凯氏定氮法(讲义)

2010‐3‐181凯氏定氮法新疆乌苏啤酒有限责任公司化验员培训教材凯氏定氮法ÁJohanKjeldahl(1849-1900),在嘉士伯实验室发明了测定凯氏定氮法,这种方法到目前仍然是我们测定谷物类物质蛋白质含量的主要方法的主要方法。样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出样中的有机氮转化为氨与硫酸结凯氏定氮法原理水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。凯氏定氮法：常量法、微量法微量凯氏定氮法样品质量及试剂用量较少，且有一套微量凯氏定氮器。目前通用以硫酸铜作催化剂的常量、半微量、微量凯氏定氮法。凯氏定氮法检测中应该注意的问题是，氮化合物中氮的完全氨化、消化时间、操作问题，催化剂的选择。样品消化蒸馏、吸收滴定一、样品制备Á用于凯氏分析的样品的制备必须十分小心,以避免引起最终结果的误差。必须把样品处理的很均匀,而且颗粒大小粒度要小于1mm1mm。Á提高分析样品的均匀度将提高方法的重现性,并可减少样品的用量而不影响最终结果的质量。使用小颗粒的样品，消化速度也将加快。2010‐3‐182样品的称重----固态的样品制备Á分析中样品的实际称重主要取决于样品的均匀度。对于不均匀的样品,若使用的样品量太少,将不能获得高的精度。而对于均匀的样品,称样没有严格要求。只要正确的选择称样量和滴定酸浓度,最终得出一个合适的滴定体积。蛋白质含量(%)样品量(mg)＜5%1000～50005-30%500～1500＞30%200～1000样品制备注意事项Á固体粉末样品:称量时最好使用折成船形的定量滤纸称量；样品转移至消化管时应缓慢将样品放入，防止样品粘附到消化管的瓶颈处，加入催化剂和浓硫酸，混均。Á液体样品：准确吸一定量的样品，移入至消化管中，转移样品时移液管应放至消化管的下部，防止样品粘、溅到消化管的瓶颈处，加入几滴浓硫酸，在砂浴或电炉上将水份蒸发到近干，不得焦化。加入催化剂和浓硫酸，混均。二、消化Á消化过程的目的：是要打破所有样品中的氮的有机结合,并使所有类型的氮都转换成铵离子。为此JohanKjeldahl最初选用了硫酸并沿用至今。Á当单独使用硫酸时，消化速度很慢。因为消化Á当单独使用硫酸时，消化速度很慢。因为消化速度(打破样品的化学结构)不仅取决于酸的性能,而且要取决于消化期间消化液的温度。温度越高，消化越快。若单独使用硫酸,消化温度将受硫酸的沸点(338℃)所限制,而氮的临界分解温度是摄氏373℃。加入一些盐类和催化剂可以使消化速度得到很大的改善。消化反应方程式如下：使有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮。，将有机物炭化后的碳化为二氧化碳，硫酸则被还原成二氧化硫浓硫酸具有脱水性，浓硫酸具有脱水性，浓硫酸又具有氧化性浓硫酸又具有氧化性2NH2NH22(CH)(CH)22COOHCOOH＋＋13H13H22SOSO44＝＝(NH(NH44))22SOSO44＋＋6CO6CO22＋＋12SO12SO22＋＋16H16H22OO①①样品消化样品消化硫酸则被还原成二氧化硫2H2SO4＋C＝2SO2＋2H2O＋CO2二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。HH22SOSO44＋＋2NH2NH33＝＝(NH(NH44))22SOSO44样品的分解条件（1）K2SO4或Na2SO4：提高溶液的沸点：CuSO4C＋2CuSO4→Cu2SO4＋SO2↑＋CO2↑Cu2SO4＋2H2SO4→2CuSO4＋2H2O＋SO2↑（2）催化剂（3）氧化剂过氧化氢加入硫酸钾可以提高溶液的沸点而加快有机物的分解，它与硫酸钾作用生成硫酸氢钾可提高反应温度一般纯硫酸的沸点在340摄氏度左右，而添加硫酸钾后，可使温度提高到4000C以上，原因主要在于随着消化过程中硫酸不断地被分解，水分不断逸出而使硫酸钾浓度增大，故沸点升高，其反应式如下：KSO+HSO=2KHSOK2SO4+H2SO4=2KHSO42KHSO4=K2SO4+H2O↑+SO3但硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过高，又会引起已生成的铵盐发生热分解而造成损失：（NH4）2SO4=NH3↑+(NH4)HSO42(NH4)HSO4=2NH3↑+2SO3↑+2H2O除硫酸钾外也可加入硫酸钠，氯化钾等盐类来提高沸点，但效果不如硫酸钾。2010‐3‐183催化剂:硫酸铜CuSO4①催化剂2CuSO4=CuSO4+SO2↑+O2C+2CuSO4=Cu2SO4+SO2↑+O2↑CuSO+2HSO=2CuSO+2HO+SO↑作用作用Cu2SO4+2H2SO4=2CuSO4+2H2O+SO2↑此反应不断进行，待有机物被消化完后，不再有硫酸亚铜（褐色）生成，溶液呈现清澈的蓝绿色。②可以指示消化终点的到达③下一步蒸馏时作为碱性反应的指示剂。消化时间一般约3-4小时左右即可，消化时间过长会引起氨的损失。但当含有特别难以氨化的氮化合物的样品，但当含有特别难以氨化的氮化合物的样品，如含赖氨酸或组氨酸时，消化时间需适当延长，因为这两种氨基酸中的氮在短时间内不易消化完全，往往导致总氮量偏低。有机物如分解完全，分解液呈蓝色或浅绿色。但含铁量多时，呈较深绿色。Á消化开始时一般以文火（低温）加热，待样品泡沫消失后，转入强火（高温）加热。Á消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进其消化完全。消化注意事项Á样品中若含脂肪较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并时时摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。Á当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30％过氧化氢2—3m1后再继续加热消化。三、蒸馏、滴定1、蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。2、氢氧化铜在70～90℃时发黑；3、加氢氧化钠前应将冷凝管下端浸入硼酸溶液中蒸馏注意事项中；4、蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面，并用蒸馏水冲洗管口，再蒸1分钟后关掉热源，否则可能造成吸收液倒吸。5、为了防止暴沸，可在蒸馏瓶中加入玻璃珠、瓷片或锌粒。吸收与滴定用20g/L硼酸吸收，用0.1mol/L盐酸标准溶液滴定，以溴甲基酚绿指示剂滴定馏出液，当溶液颜色由绿色消失转变为灰紫色，即为终点。溴甲酚绿（3854）蓝黄绿溴甲酚绿（3.8～5.4）蓝黄绿2010‐3‐184自制蒸馏装置必须使用定氮球。所用试剂溶液应用无氨四、仪器装置检查所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。蒸馏器的校正Á配制15-25%硫酸铵溶液（99.5～99.9%）；Á连接仪器蒸馏，测定蒸馏液中氮的含量。Á蒸馏器的回收率应保证控制在99.5～101%范围内。消化系统的校正Á甘氨酸的氮含量是18.66％，色氨酸的氮含量是13.73％。Á称取上述任一种纯净物质约500mg，包括消化在内的回收率误差应在正负1%以内消化在内的回收率误差应在正负1%以内。Á按蛋白质消化的步骤进行测定蛋白质，计算回收率。