质粒构建流程

质粒构建流程一、引物设计1）取得目的基因序列，可选用数据库NCBI2）软件分析目的基因可用酶切位点。使用primer5分析出序列不包含的酶切位点，即为可用没切位点。3）选择载体。根据转染细胞和实验室资源，选择合适载体。如pcDNA3.1(+)，4）选择酶切位点。对照目的基因可用酶切位点和载体上的酶切位点，选择二者共有的作为备选。载体上两个酶切位点的距离应有几十bp以上，选实验室常用酶切位点。5）使用primer5设计目的基因引物，目的产物应包含从启动子到终止子全部碱基。6）根据选择的酶切位点，查找对应的酶切位点保护碱基，将对应片段添加到设计的引物两端，注意酶切位点的前后顺序。一般选择三个保护碱基。7）引物设计完成，送公司合成。二、目的片段获取1.RNA提取试剂盒：Bioteke高纯总RNA快速提取试剂盒离心柱型（裂解液RL4℃、漂洗液RW-20℃保存）准备：冰盒、4℃预冷离心机、EP管2套、吸附柱RA一套操作步骤：1）将1000μl裂解液RL加入细胞中，混合5min。2）加200μl氯仿混合，震荡15s，室温孵育3min。3）4℃，12000rpm离心10min。4）最上层水相转移至新EP管中（体积约550μl）5）加入1倍体积（550μl）70%乙醇，混匀6）全部转移到套收集管的吸附柱RA中，4℃，10000rpm离心45s7）弃废液，重套收集管，加500μl去蛋白液RE，12000rpm离心45s8）弃废液，重套收集管，加700μl去漂洗液RW，12000rpm离心60s9）弃废液，重套收集管，加500μl去漂洗液RW，12000rpm离心60s10）弃废液，重套收集管，12000rpm空离2min11）吸附柱放入新EP管，加50μlRNasefreewater于膜上，室温放置2min12）4℃，12000rpm离心60s13）点样：5μlRNA+1μl10×buffer，1.5%琼脂糖凝胶电泳，100V，3min，可见3条亮带。14）-20℃保存2.RNA反转录试剂盒：TaKaRaprimescriptRTreagentkitwithgDNAeraser（-20℃保存）准备：冰盒，②④⑤⑥取出解冻，①③为酶不可取出，预冷离心管操作步骤：1）基因组DNA去除（10μl体系）②5×gDNAeraserbuffer2μl①gDNAeraser1μlTotalRNA4μl(可根据RNA浓度调整)⑥RNasefreewater3μlPCR仪中进行，程序：42℃，2min→4℃注：RNA的量可根据浓度调整，混合液冰上配制，酶最后加入2）反转录反应（20μl体系）④5×primerScriptbuffer24μl③primerScriptRTenzymemixI1μl⑤RTprimermix1μl⑥RNasefreewater4μl1）反应液10μlPCR仪：37℃，15min→85℃，5s→4℃注：可直接将第2步反混合液好后加入到第1步反应液中3）1.5mlEP管收集，-20℃长期保存3.PCR扩增高保真酶primerstar扩增，50μl体系如下：5×PSbuffer10μldNTP4μldH2O32.5μlPrimerstar0.5μlcDNA1μl(可变)R-primer1μlF-primer1μl点样：5μlPCR产物+1μl6×buffer，1.5%琼脂糖凝胶电泳，100V，15min4.PCR产物纯化1）液相纯化（产物电泳结果只含目的条带）试剂盒：Microelutecycle-purespinprotocol(OMEGAbio-tek)D6293-01①将PCR产物加入1.5mlEP管，加入5倍体积bufferCP，混匀。②转移至HiBindMicroElutionDNA柱（套收集管），室温离心10000g，1min。③弃废液，加700μlDNAwashbuffer（含乙醇）到柱子，室温离心10000g，1min。④弃废液，重复③⑤弃废液，空管离心13000g，1min⑥柱子放入新EP管，加10-20μlElutionbuffer到膜上，室温孵育3-5min，离心10000g，1min⑦电泳检测2）割胶回收（产物电泳结果含杂带）①将含目的条带的琼脂糖凝胶切下（切得尽量小），放入1.5mlEP管。②加等体积（1g=1ml）bindingbuffer（XP2）,60℃金属浴7min左右至胶溶解（溶液为淡黄色），混匀2min③溶液加入离心柱，离心10000g，1min，废液倒回再离一次④弃废液，加300μlbindingbuffer（XP2），离心10000g，1min⑤弃废液，加700μlSPWwashingbuffer，离心10000g，1min⑥重复⑤⑦空管离心13000g，2min，弃废液，柱子转移到新EP管⑧加入30-50μlelutionbuffer于膜上，室温孵育1min，离心13000g，1minPCR程序：95℃5min95℃30s56℃30s35cycle72℃1min72℃10min注：可根据不同基因调节退货温度，延伸时间，循环数。⑨电泳检测三、双酶切30μl反应体系如下：PCR纯化产物15μl10×M/L/Kbuffer3μl3dH2O10μl酶A1μl酶B1μl反应条件：takara酶30℃水浴1h→65℃金属浴10min终止反应注：buffer类别依使用的酶具体选择，见附表四、连接1）双酶切后，可将质粒酶切产物琼脂糖电泳1-2μl2）酶切产物液相纯化3）20μl连接体系（皆可）PCR产物5μlpcDNA3.12μl10×T4buffer2μlT4ligase1μl3dH2O10μlPCR仪中进行：22℃，30min→4℃冰箱过夜注：连接产物-20℃可长期保存五、转化准备：碎冰，灭菌EP管、LB空液体培养基，带抗性培养板，超净工作台，移液枪，水浴锅加热42℃1）将感受态细胞置于冰上，待其融化2）超净工作台中，将连接产物10μl加入100μl感受态细胞，或质粒1-3μl加入100μl感受态细胞3）轻混匀，冰浴30min4）热击水浴42℃，45s，冰浴1min5）加900μlLB空培养基，摇菌150rpm，37℃，1h6）浓缩离心13000rpm，1min，上清液留约200μl重悬菌体，部分涂板（50-100μl）7）完全吸收后，37℃倒置培养12-16h六、菌落PCR1）以rTaq酶50μl体系配制PCR反应液，每个PCR管分装15μl，体系如下：3dH2O35.7μl10×buffer5μlMgCl23μldNTP4μlrTaq0.3μlR-primer1μlVector12μl10×M/L/Kbuffer3μl3dH2O13μl酶A1μl酶B1μlPCR产物6.3μlpcDNA3.10.7μl10×T4buffer2μlT4ligase1μl3dH2O10μlPCR程序：95℃5min95℃30s56℃30s35cycle72℃1min72℃10min注：程序与DNA扩增一样F-primer1μl2）灭菌牙签挑单菌落放入PCR体系中搅一下，再在新板划板（注意编号），每板挑10个菌。新划的板37℃倒置培养12-16h。3）琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，记录含目的条带的菌落号备用。七、测序1.摇菌1）PCR检测有目的条带的菌落，挑选2-3个较好的以供摇菌2）三角瓶中分装10mlLB抗性液体培养基3）用10μl枪头挑起选择的菌落打到培养基中4）37℃。250rpm摇菌12-16h2.送样每瓶取1ml箘液，送华大基因测序3.比对将测序结果与基因序列进行比对，比对正确则构建成功，比对错误则重新构建。（注：数据库中基因序列可能有误，若出现少数突变，可换其他数据库比对试试）八、菌种保存菌种比对成功，则可保存菌种备用。1）超净工作台中取1.5mlEP管，加200μl80%灭菌甘油。2）再加入800μl箘液，轻混匀。3）液氮冻存。（一个基因冻2管即可）九、质粒提取菌种比对成功，冻存菌种后，箘液用于提取质粒。试剂盒：AXYGENaxyprepplasmidminiprepkit250-prep操作步骤：1）取3-5ml箘液，室温下离心10000g，1min2）弃上清，加250μlsolutionI/RNaseA重悬菌落，混匀3）加250μlsolutionII，倒置轻混匀，孵育2min。（整个裂解反应不超过5min）4）加入250μlsolutionIII，立即倒置混匀，直到生成白色絮状沉淀。5）室温离心13000g，10min6）上清液小心转入HiBindminiprepcolumn(有套管)，室温离心10000g，1min7）弃废液，加500μlbufferHB，室温离心10000g，1min8）选择性步骤：重复第7步9）弃废液，空管室温离心13000g，2min10）柱子转入新EP管，加30-50μlelutionbuffer或3dH2O到膜上，室温孵育1-2min11）室温离心13000g，1min12）提取的质粒-20℃保存备用附：感受态制备方法（皆采用LB空白培养基）：1.菌种活化1）用接种环直接取冻存的E.coli/DH5α菌种，在LB平板上划线，37℃倒置培养16h2）挑单菌落转到2-10mlLB液体培养基中，摇菌37℃，250rpm，12-16h3）取1ml箘液加入到100mlLB液体培养基，摇菌37℃，250rpm，3h4）检测箘液OD600≤0.5（0.3-0.4）2.感受态制备准备：0.1MCaCl2灭菌，50ml离心管灭菌，冰水，1.5ml离心管冰上预冷，离心机4℃预冷。步骤：1）将箘液用50ml离心管分装，调平，4℃离心3000rpm，8min2）弃上清，0.1MCaCl210ml重悬（冰水中进行，动作轻），两管合成一管3）冰上放置一段时间，4℃离心2500rpm，8min4）弃上清，0.1MCaCl210ml重悬，4℃冰箱过夜沉淀5）上清液取出8ml，剩2ml，加670μl80%甘油（箘液：80%甘油=3:1），轻混匀6）1.5mlEP管分装，每管分装100μl，液氮冻存。试剂配制：1.琼脂糖凝胶（1.2%）琼脂糖粉0.6g1×TAE50ml微波炉加热溶解，冷却一会儿后加入1μlgoldview核酸染料，混匀，倒板2.电泳缓冲液TAE（50×）2mol/Ltris-碱242g1mol/L冰醋酸57.1mlEDTA(pH8.0)18.622g二蒸水至1L用NaOH调节pH至8.6，常温储存。用时稀释成1×溶液使用。3.LB培养基Yeastextract（酵母提取物）1gTryptone2gNaCl2gAgarpowder（琼脂粉）3g（配1.5%固体培养基时加入）二蒸水200ml灭菌20min，冷却后加入抗生素。4.CaCl2（0.1M）CaCl21.47gH2O100ml