第四次分生讨论课问题四整合课件

基因工程设计方案有关该题目的具体分析•已知目的基因的cDNA序列(GenBank登录号:AK135903.1)，拟采用基因工程技术在哺乳动物细胞中表达该序列中的133-1941位核苷酸序列，请设计实验方案。该问题我们主要分五个个方面来实行实验方案•1.目的基因的获取•2.表达载体的选择•3.外源基因导入宿主细胞•4.目的基因的筛选与鉴定1.目的基因的获取•主要分以下几个方面进行阐述•（1）对资料genebank中的基因的分析•（2）cDNA的获取•（3）cDNA的扩增•（4）cDNA后续处理（1）对资料genebank中的基因的分析•经过在pubmed中的nucleotide中查找AK135903.1号基因，得到如下结果：•MusmusculusinvitrofertilizedeggscDNA,•RIKENfull-lengthenrichedlibrary,•clone:7420435F10product:zonapellucidaglycoprotein2•fullinsertsequence小家鼠体外受精卵的cDNA日本理化研究所全长序列文库卵透明带糖蛋白2完整的插入序列以下是查找到的全长基因序列该cDNA序列共2234个bp的碱基（2）cDNA的获取•分为以下几个步骤：•Ⅰ.小鼠卵透明带糖蛋白2的mRNA的提取•Ⅱ.mRNA的逆转录为cDNA•Ⅲ.cDNA形成双链进行扩增Ⅰ.小鼠卵透明带糖蛋白2的mRNA的提取&Ⅱ.mRNA的逆转录为cDNA•利用TRIZOL发抽提雌性小鼠的卵细胞中的所有RNA得到以下图示结果：•5’m7Gppp---------------------------------AAA3’(抽提的mRNA）5’m7Gppp---------------------------------AAA3’（mRNA）----------------------------------（cDNA）Oilgo（dT）引物特异性设计的引物（只对卵透明带糖蛋白2mRNA中序列特异性识别）AMV反转录酶，缓冲液第一股链合成≈45℃，60minⅢ.cDNA形成双链进行扩增5’m7Gppp---------------------------------AAA3’（mRNA）----------------------------------TTT（cDNA）•----------------------------------AAA3’•----------------------------------TTT5’RNaseHDNA-polⅠ缓冲液第二股链的合成≈14℃2h双链DNA得到稳定的cDNA双链（也就是得到了AK135903.1号cDNA）（3）cDNA的扩增•首先我们必须得设计好引物，本次实验的目的是扩增出133-1941位中的核苷酸链。因此在扩增之前必须得先设计primer•设计引物的方法：走•以下是设计引物的一个过程：设计引物的过程：•使用pubmed中查找到AK135903.1的cDNA序列后使用后进入页面后可以筛选出建议的primer。经过之前讲的原则的分析后得到了一对扩增引物（包含了133-1941位点的扩增片段）见下所示Tm:55-65℃GC%：40%-60%cDNA的扩增•----------------------------------3’•5’-----forwardprimer•Reverseprimer-----3’•----------------------------------5’进行PCR扩增进行PCR扩增后，就得到高浓度的cDNA分子了（4）cDNA的后续处理•获得高浓度的cDNA分子之后，由于末端扩增出的片段与表达载体并不匹配，因此为了更好的进行表达载体的构建，因此我们还需要对获得懂得cDNA进行后续的处理。•以下为扩增后的cDNA分子处理：•----------------------------------AAA3’•----------------------------------TTT5’•----------------------------------AAA3’•----------------------------------TTT5’T4DNA连接酶dNTP人工合成接头修齐末端37℃10min人工接头2.表达载体的选择与构建•（1）表达载体的选择•我们从题目中知道扩增出来后的基因序列＜10k一般选用质粒作为表达载体。一下是有关表达载体的对比示意图。（2）表达载体的构建•目的基因与表达载体的构建•人工合成的基因接头常常在表达载体上都有特定的限制酶切割位点，用同样的限制酶对表达载体进行切割后进行拼接。•剪接好的cDNA------------------剪接好的质粒在DNA连接酶的作用下连接表达载体构建成功PCR引物的选取原则•①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。•②产物不能形成二级结构。•③引物长度一般在15~30碱基之间。•④G+C含量在40%~60%之间。•⑤碱基要随机分布。•⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。•⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。•⑧引物5′端可以修饰。•⑨引物3′端不可修饰。•⑩引物3′端要避开密码子的第3位。返回目的基因导入受体细胞植物的遗传转化转基因动物技术植物遗传转化的主要方法农杆菌介导的遗传转化基因枪法电击法注射法化学药剂诱导转化花粉管通道法转基因动物（受精卵原核）显微注射法迄今较为普遍最有成效（小鼠、绵羊、猪、大鼠、兔、牛、鱼...）导入的外源基因片段可长达50kp，且无需载体。难以控制整合率，检测必须等到子代出生。逆转录病毒感染法(小鼠、家禽)逆转录病毒核酸单链RNA反转录酶↓反转录细胞核基因组←双链DNA整合率高100%逆转录病毒载体对于多细胞转化的优越性（培育转基因禽类研究中有广泛应用，目前制备转基因禽类最有效和最成功的方法）只能转移小片段DNA(≤10kb)潜在的致癌性重组→整合胚胎干细胞（Embryonicstemcells）法外源基因直接导入ES细胞→筛选、富集被转染的细胞→注入受体囊胚腔→移入假孕个体→获得转基因动物能在细胞水平进行筛选和确定性别能随机整合和同源重组整合基因打靶能加入、剔除或替换某个基因（小到一个或几个核苷酸）目前ES细胞仅在小鼠、鸡和人的早期胚胎中分离出来ES细胞的培养条件苛刻、技术要求高,成本大目的基因的筛选与鉴定制作人---莫思凡•目的：筛选含有目的基因的阳性克隆并加以扩增。•首先：筛选出带有载体的克隆•其次：筛选出带有重组体的克隆•最后：筛选出带有特异DNA序列的克隆•方法：•遗传学方法•核酸杂交法•酶切鉴定•PCR技术•免疫学方法遗传学方法•（一）抗药性标记插入失活筛选法（插入灭活法）在基因工程中使用的所有载体分子,都至少含有一个选择标记。载体常有抗生素抗性基因,如氨苄青霉素抗性基因（Ampr）、四环素抗性基因（Tetr）、卡那霉素抗性基因（Kanr）。•（二）β-半乳糖苷酶显色反应筛选法（α-互补）β-半乳糖苷酶基因的显色反应,将重组体DNA分子的转化子同非重组的载体转化子区别开来.（一）抗药性标记插入失活筛选法检测外源DNA插入作用的一种通用方法是插入失活效应。1.以真核表达载体为例（1）真核表达载体应具有的特性在真核表达载体上有两个抗生素基因，Ampr基因内有一个PstⅠ限制性核酸内切酶的唯一识别位点，Tetr基因内有BamHⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶单一识别位点。（一）抗药性标记插入失活筛选法1.以真核表达载体为例（2）筛选重组体的原理在Ampr和Tetr这两个基因内的任一插入作用，都会导致Ampr基因或Tetr基因出现功能性失活，于是，所形成的重组质粒都将具有AmpsTetr或Amprtets的表型。当外源DNA片段插入真核表达载体DNA的BamHⅠ或SalⅠ位点时，抗四环素基因失活（TetrTets），重组体转化子必定具有AmprTets表型。因此，将转化菌先涂布在含有Amp的琼脂平板上，并将存活的Ampr菌落原位影印到另一个含有Tet的琼脂平板上，凡是在Amp平板上生长，而不在Tet平板上生长的菌落，就必定是已经插入了外源DNA片段的重组质粒转化子克隆.如下图所示同样,在真核表达载体的Ampr基因序列中,利用PstⅠ限制性核酸内切酶识别位点,插入外源DNA片段,也能应用插入失活作用检测重组质粒,当然,所挑选的菌落就应该是具有AmpsTetr的表型（一）抗药性标记插入失活筛选法载体载体载体AmprTetrAmprTetrAmprTets+菌落原位影印Amp琼脂平板Tet琼脂平板图应用抗生素抗性基因插入失活筛选重组体（二）β-半乳糖苷酶显色反应筛选法1.乳糖操纵子的结构阻遏蛋白β-半乳糖苷酶β-半乳糖苷透过酶β-半乳糖苷乙酰基转移酶mRNAmRNAlacAlacYlacZlacOPZYAlacIPIRNA聚合酶（二）β-半乳糖苷酶显色反应筛选法2.β-半乳糖苷酶显色反应筛选法原理有许多质粒载体具有β-半乳糖苷酶显色反应的检测功能.应用这些载体系列，当外源DNA插入到它的lacZ基因上时，可造成β-半乳糖苷酶的失活效应，就可通过大肠杆菌转化子菌落在添加X-gal-IPTG培养基中的颜色变化鉴别出重组子和非重组子。（二）β-半乳糖苷酶显色反应筛选法3.举例pUC质粒：带有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多种限制性核酸酶单一识别位点的多克隆位点，但并没有破坏lacZ的阅读框架。大肠杆菌菌株：带有β-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。在各自独立的情况下，pUC质粒和大肠杆菌编码的β-半乳糖苷酶片段都没有活性。（二）β-半乳糖苷酶显色反应筛选法3.举例当质粒转化大肠杆菌后,可形成具有酶活性的蛋白质,它在生色底物X-gal的存在下被IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入到pUC质粒的多克隆位点上后，则会导致读码框架改变，表达蛋白失活，因此，在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。因此，根据这种β-半乳糖苷酶的显色反应，可将重组质粒与自身环化的载体DNA分开。将噬菌体感染形成的噬菌斑影印在硝酸纤维膜上变性带有目的基因的放射性DNA或cDNA作探针进行杂交放射性自显影杂交信号（黑点）对应的噬菌斑即为阳性克隆。核酸分子杂交检测法（1）菌落印迹原位杂交菌落印迹原位杂交的优点是：适于高密度菌落的筛选,对于噬菌斑平板,它可以连续影印几张同样的硝酸纤维滤膜,获得数张同样的DNA印迹。因此，能够进行重复筛选，效率高，可靠性强，而且可以连续使用两种或数种探针筛选同一套重组体DNA，是一种最常规的检测手段。(2)核酸分子杂交：①.Southern杂交分析：由英国Southern（1975）发明，将琼脂糖中DNA转移到尼龙膜进行DNA分子杂交分析的方法。筛选基因库得到阳性克隆将限制性酶酶切与Southern杂交结合绘制限制性酶图谱。②.Northern杂交分析：与Sorthern杂交的原理和程序相同。用于分析克隆的基因在某一细胞或组织的转录水平，检测mRNA的存在。物理检测法(酶切鉴定)重组质粒的快速提取与酶切鉴定经过遗传筛选得到的阳性克隆还必须进一步进行鉴定，酶切鉴定是最常用的方法之一。通过提取“阳性克隆”的质粒，酶切分析“阳性克隆”中质粒的大小和酶切图谱，通过这种方法鉴定载体中是否含有外源DNA片段，载体中是否含有正确的目的DNA片段。这种方法判断的标准是目的DNA分子和载体的分子大小及酶切图谱。Mr12345678910Mr:DNA分子Marker;1:目的DNA片段;2:目的DNA片段EcoRⅠ酶切;3:空载体EcoRⅠ酶切;4-10:为不同”阳性克隆”质粒的EcoRⅠ酶切分析;从图中可看出:4、5泳道为不含插入片段的空载体；6、9泳道虽然含有外源DNA片段，但因为插入片段的大小和酶切图谱与目的片段不同，