细菌和噬菌体的遗传重组

第六章细菌和噬菌体的遗传重组InheritanceinBacteriaandbacteriophages迄今为止，我们所讨论的均是有减数分裂的真核生物的遗传特点，而没有核、不进行减数分裂的原核生物（细菌、病毒等）的遗传物质又是如何传递的呢？T4噬菌体细菌的细胞和基因组1-2μm（长）×0.5μm（宽）DNA长约1100μm；分子量约2.6×109细胞结构-----与真核细胞的差异：缺乏线粒体、叶绿体，无核膜。荚膜鞭毛拟核细胞壁细胞膜核糖体2μm细菌的菌落裸露的、闭合环状、双链DNA分子，以折叠或螺旋状态的高度组装形式存在。细菌的染色体细菌的染色体（电镜照片）细菌和病毒的拟有性过程真核生物基因分离、自由组合及连锁交换均通过有性过程(减数分裂——受精)实现。细菌和病毒均属于原核生物，不存在严格意义上的有性过程。细菌细胞内除了染色体外还有一些寄生性复制因子（如噬菌体和质粒），又称核外或染色体外因子，可以在细胞间传递，并形成细菌染色体间以及细菌染色体与核外遗传因子间的重组体。拟有性过程——引起细菌、病毒间遗传物质转移与重组的过程。细菌的细胞分裂E.coli基因组：E.coli4.6Mb，4288genes90%编码蛋白质细菌的突变型及其筛选E.coli突变类型合成代谢功能的突变型：甲硫氨酸缺陷型：met-（营养缺陷型）其相应的野生型：met+抗性突变型：青霉素抗性菌株：penr（抗生素抗性突变型）青霉素敏感性菌株：pens分解代谢功能的突变型：乳糖突变型：lac-（碳源突变型）其相应的野生型：lac+（一）营养缺陷型在营养代谢上是有缺陷的菌株，统称为营养缺陷型，而把正常的野生型叫做原养型。基本培养基：能满足野生型菌株营养要求的最低成分的组合培养基。补充培养基：在基本培养基中有针对性地加上某一种或几种其自身不能合成的成分，以满足相应营养缺陷型生长的培养基。完全培养基：在基本培养基中加入一些富含生长因子的物质，以满足该微生物各种营养缺陷型要求。病毒的结构病毒的一般特性无细胞结构----为蛋白质外壳包裹核而成的颗粒形体极微小----电子显微镜下观察化学组成简单----核酸（DNA或RNA）和蛋白质缺乏独立代谢能力----依赖宿主（但宿主范围比较窄）繁殖方式独特----依赖宿主活细胞的代谢机制，通过核酸复制和蛋白质合成后再装配成完整的病毒颗粒具有双重存在方式----或专性寄生在活细胞内，或在细胞外以大分子颗粒状态进行传播对干扰素敏感，而对抗生素不敏感细菌和病毒在遗传研究中的优越性世代周期短----大肠杆菌（Escherichiacoli）20分钟即可繁殖一代易于管理和进行化学分析----用一支试管就可贮存数以百万计的细菌或病毒，在短期内累积大量产物，为化学分析提供条件。遗传物质较简单----只有一个裸露的DNA或RNA分子便于研究基因的突变----裸露的DNA分子（有的噬菌体为RNA分子），容易受环境条件的影响而发生突变；单倍体生物，不存在显性掩盖隐性问题，隐性突变也能表现出来。便于研究基因的作用----细菌可以生活在基本培养基上，易于获得营养缺陷型，也易于测知各种营养缺陷型所需要的物质，可以从生化角度研究基因的作用。可作为研究高等生物的简单模型----可以从微生物的研究中得到模型，并从中获得启发，为开展对高等生物的的遗传研究开拓思路。细菌基因重组的方式一个细菌细胞的DNA与另一个细菌细胞DNA的交换重组可以通过四种不同的方式进行：–转化–接合–性导–转导第一节细菌转化transformation一、转化的发现二、转化过程三、共同转化与遗传图谱绘制转化（transformation）转化------是指某些细菌（或其他生物）能通过其细胞膜摄取周围供体（donor）的染色体片段，并将此外源DNA片段通过重组整合到自己染色体组的过程。转化中，提供遗传物质的细胞称为供体（donor），接受供体遗传物质的称为受体（receptor）。只有当整合的DNA片段产生新的表现型时，才能测知转化的发生。一、转化的发现转化的两个实验在下一章介绍。转化过程不同细菌转化过程有一定差异，但是它们都存在几个共同特征：1.供体DNA与受体细胞结合——吸附2.DNA的穿入和摄取——吸收3.联会与外源DNA片段整合转化过程双链DNA与细胞表面感受位点可逆性结合联会双交换引起重组单链DNA插入受体细胞DNA中，形成杂合体杂合的DNA经复制可以形成亲本型和重组型DNA，导致转化细胞的形成与表达。进入受体细胞的供体DNA转为单链，另一条链被降解。转化子：细菌细胞经过转化所形成的各种重组子。转化的特点：1、转化时基因重组只发生在供体和受体的同源区域之间；2、不存在相反的重组子；3、只有双交换和偶数次交换才能形成重组子。转化作图+++trp2his2tyr1Rf＝×100％＝58.8%196+328196+328+367独立片段连锁片段共转化频率越高，连锁越紧密。第三节细菌的接合conjugation一、E.coli接合的发现1946年Lederberg和Tatum发现细菌的接合。细菌接合：是指通过细菌细胞的直接接触，遗传物质从供体细胞单向转移到受体细胞的过程。接合现象的发现和证实1946年，J.Lederberg&E.Tatum大肠杆菌杂交试验：材料：大肠杆菌K12菌株的两个营养缺陷型品系：菌株A—甲硫氨酸缺陷型met-和生物素缺陷型bio-菌株B—苏氨酸缺陷型thr-和亮氨酸缺陷型leu-方法：将A、B两菌株混和，在基本培养基（固体）上涂布培养。结果：平板上长出原养型菌落(++++)。上述试验获得的原养型菌落可能产生于：亲本菌株A或B发生了回复突变；两品系细胞通过培养基交换养料—互养作用；两品系间发生了转化作用；发生细胞融合，形成了异核体或杂合二倍体。为了验证这些原养型菌落产生的可能而进行的研究最终表明：这些解释均不成立。结果分析回复突变可能的排除Lederbery和Tatum利用的双营养缺陷型菌株进行试验，已基本排除A或B品系发生回复突变产生原养型细菌的可能。因为：•单基因回复突变的频率约为10-7；•双基因回复突变的频率则为10-14，频率很低。•但试验中产生原养型菌落产生的频率非常高（10-7），因此基本可以排除回复突变的可能。互养作用及其排除•试验材料A品系：A-B+T1S(met-bio-thr+leu+T1S)；B品系：A+B-T1R(met+bio+thr-leu-T1R)。•试验方法：将A、B品系混合接种在基本培养基表面，短时间后喷噬菌体T1杀死A品系，使其不能持续产生thr与leu供B品系持续生长。•结果：仍然出现原养型菌落。•结论：表明互养并非原养型菌落出现的原因，而可能发生了遗传重组。转化作用及其排除•Lederbery和Tatum：在混合液中添加DNA酶，仍然出现原养型菌落。•戴维斯(Dawis,1950)的U型管试验：•结果：任何一臂的培养基上均未长出原养型细菌。•结论：细胞直接接触（接合）是原养型细菌产生的必要条件，从而否定了转化的可能。两种培养基中间放置一个滤片→一边加压和吸引使培养液充分混合二、单向转移与F因子1952年，W.HayesA菌株B菌株链霉素AB混合培养，原养型重组体链霉素BA混合培养，×细菌接合中遗传物质转移是单向过程（即从A→B株）细菌分为两个类群（两种接合型)供体（或雄菌株）受体（或雌菌株）F因子及其转移供体或雄性细菌细胞内有一种致育因子（fertilityfactor，F），用F+表示。存在于细菌细胞中，赋予细菌以性别的并能独立增殖的环状DNA分子。染色体外的一个共价环状DNA分子（94.5Kb；细菌DNA的2%；1/3基因与接合有关)。接合：原核生物中，遗传物质从供体（“雄性”）转移到受体（“雌性”）的过程。F因子①原点：转移的起始位点②致育基因群：包括性伞毛基因、转移基因等。③自主复制区④配对区：与染色体配对，交换后插入染色体。自主复制区据F因子有无以及存在状态E.Coli有三种类型：F-不含有F因子F+含有一个自主状态的F因子Hfr（高频重组菌株）含有一个整合到染色体上的F因子F因子中有形成F纤毛（Fpill）的基因→结合管→F+细胞中的F因子由结合管向F-传递→F-受体变成F+F+×F﹣→F+F菌毛启动细胞间的连接F因子通过复制在子细胞中产生一个新拷贝在供体细胞中保持一个拷贝的F因子三、F+菌株的特点①F+细菌可以把F因子传给后代。②F+细菌经吖啶橙处理F因子丢失，也可以自发丢失F因子，丢失后不再出现。③F+可以和F-杂交，而不能和F+杂交。④F+和F-杂交，可将F-转化为F+，但为低频重组（因为：F因子的整合频率为每代10-5~10-7）。第四节高频重组品系一、F+→HfrHfr×F-细菌染色体由一小段单链的F因子为前导而转移到F-受体→边转移边合成（边交换）。一般情况下，仅小部分细菌染色体能转入→接合管中断→控制合成伞毛的基因没有进入受体细胞→受体细胞仍为F-。Hfr×F-→多数为F-二、部分二倍体：当F+或Hfr的细菌染色体进入F-后，在一个短时期内，F-细胞内的某些位点就会成为二倍体DNA。外基因子内基因子不能复制，细菌不能繁殖重组型不能复制，丢失重组发生在部分二倍体中；单交换产生不平衡的线性染色体；只有偶数次交换才能产生平衡的重组子；相反的重组子不出。①F因子可以整合到细菌染色体的不同位置上。②Hfr×F-，Hfr使两个菌株杂交后所产生的重组体频率大大增加（比F+×F-高1000倍）。③Hfr×F-，F因子的传递频率非常低，受体一般为F-。三、Hfr菌株的特点：四、Hfr品系与F+菌株的异同相同•都能和F-杂交；•杂交都要通过接合管和受体菌相联接；•高剂量链霉素处理后都不影响杂交，说明它们都是作为一种供体。不同•产生重组子频率不同：Hfr×F-（10-4），F＋×F-（10-7）。•F＋×F－后代F＋，Hfr×F-后代F-。•F＋细菌经吖啶橙处理变成F－，Hfr经吖啶橙处理仍为Hfr。五、重组频率的计算原理：Hfr×F-杂交中染色体是定向地、均匀地、逐渐进入F-细菌的，大部分F因子并没有进入受体，随接合管断开（中断杂交）的时间不同，进入的基因也不同。目的：推断基因在细菌染色体上的排序。巴斯德实验室，ElieWolliman和FrancoisJacob（1954）。（一）中断杂交实验（interruptedmatingexperiment）1.接合：把Hfr菌株与F-菌株混合培养在完全培养基上。Hfr：strsthr+leu+azirtonArgal+lac+F-：strrthr-leu-azistonAsgal-lac-中断杂交试验过程：2.中断接合：培养一定时间取样，把菌液放在搅拌器内搅拌。3.杀死Hfr菌株：稀释接种到含有链霉素的选择培养基上。4.检出F-所含供体基因5.作图中断杂交作图：根据供体基因进入受体细胞的顺序和时间绘制连锁图的技术。（二）中断杂交作图实验特点：1.Hfr菌株标志基因进入F-细胞中时间不同，达到最高水平的时间也不同；2.随时间的推迟，某个基因的重组率增加；一定程度后，重组率便不再增加。Hfr类型原点基因转移顺序──────────────────────────HfrHOthrprolacpurgalhisglythi1Othrthiglyhisgalpurlacpro2Oprothrthiglyhisgalpurlac3OpurlacprothrthiglyhisgalAB312Othithrprolacgurgalhisgly–Wollman和Jacob用不同的Hfr品系进行了大量的中断杂交试验，并作出了基因的连锁图。几个Hfr菌系的中断杂交试验及其连锁图：3121thrpurgalhisglythiprolac差异原因：由于F因子插入环形染色体的位置不同以及配对方向不同（插入序列IS有极性），因此不同Hfr菌株转移的原点(O)和转移方向不同。Circularg