第14章基因重组和基因工程

基因重组和基因工程GeneticRecombinationandGeneticEngineering王海河中山医学院第14章DNA克隆、测序与重组技术的历史1973年，StanleyCohen等人首次获得体外重组DNA的分子克隆1977年，AllanMaxam和WalterGilbert的化学裂解DNA测序问世不久，Sanger等的双脱氧测序法20世纪90年代启动人类基因组计划(humangenomeproject，HGP)重组DNA技术学(RecombinantDNATechnology)接合作用(conjugation)转化作用(transformation)转导作用(transduction)转座重组(transposition)同源重组(homologousrecombination)位点特异的重组(site-specificrecombination)第一节自然界DNA重组和基因转移DNARecombinationandGeneTransferinNature发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologousrecombination)，又称基本重组（generalrecombination）。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制的Holliday模型。一、同源重组E.Coli的同源重组机制RecBCD复合物具有三种酶活性：核酸外切酶、核酸内切酶、解螺旋酶Chi位点：序列为5’GCTGGTGG3’，是目前发现的主要重组热点RecA酶：E.coli同源重组过程中最重要的酶，又称为重组酶。可结合单链DNA，并将此DNA插入双链DNA分子的同源区，完成DNA分子间单链交换的重组过程。Holliday模型的4个关键步骤：两个同源染色体DNA排列整齐；片段重组体(patchrecombinant)拼接重组体(splicerecombinant)一或两个DNA中的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体；通过分支移动产生异源双链DNA；Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：内切酶(recBCD)DNA侵扰(recA)分支迁移(recA)内切酶(recBCD)DNA连接酶5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´3´3´5´3´5´3´3´5´5´3´5´3´5´3´Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´5´5´3´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´内切酶(ruvC)内切酶(ruvC)DNA连接酶DNA连接酶拼接重组体片段重组体Holliday模型目录异源重组体的修复目录异源双链重组体内不配对片段的DNA修复二、细菌的基因转移与重组（一）接合作用当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用(conjugation)。可接合质粒如F因子(Ffactor)细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。质粒（二）转化作用通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用(transformation)。例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。（三）转导作用当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用(transduction)。λ噬菌体的生活史溶源菌生长途径(lysogenicpathway)“和平共处”溶菌生长途径(lysispathway)“杀死宿主”三、位点特异重组(site-specificrecombination)•位点特异性重组发生在特殊序列对之间，这一重组型式最早在λ噬菌体的遗传学研究中发现。•λ噬菌体有两种存在型式：裂解状态和溶源状态。两种类型间的转换通过位点特异性重组实现。溶源菌生长途径溶菌生长途径λ噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合；反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒cDNA的长末端重复序列(longterminalrepeat,LTR)。（一）λ噬菌体DNA的整合λ噬菌体DNA的整合与切除为了进入溶源状态，游离的DNA必须整合（intergrate）到细菌DNA中去；而为了从溶源状态向裂解状态转化，原噬菌体DNA则必须从细菌染色体DNA上切除（excise）。整合和切除均通过细菌DNA和λDNA上特定位点—附着点（attachmentsite，att）之间的重组而实现。细菌染色体上的附着点（attλ）称为attB，含有B、O、和B’三个序列（BOB’），长度约25bp。attB突变后可以阻止λDNA的整合。O序列15bpλ噬菌体的附着位点称attP，由P、O和P’三个序列组成，长度约为240bp。其中O序列是attB和attP所共有的，序列完全一致，长度15bp,称核心序列（coresequence）。是位点特异性重组发生的地方。O序列IntegrationHostFactor2.λ-DNA从E.coli的切离：噬菌体的整合和切除1.λ-DNA对E.coli的整合：BOP’—POB’（原噬菌体）BOB’（细菌）+POP’（噬菌体）IntIHFBOP’—POB’（原噬菌体）BOB’（细菌）+POP’（噬菌体）Int，XisIHF整合过程◘整合后的附着位点为attL（BOP’）attR（POB’）◘整合位点---attB、attP切除位点---attL、attR◘整合过程需要Int和IHF共同作用•切除过程还需要Xis蛋白，Xis通常抑制整合。调节和启动转录LTRgagpolenvsrcLTR长末端重复序列癌基因正常的病毒基因产生病毒表面糖蛋白产生逆转录酶和整合酶产生病毒垮膜蛋白反转录病毒基因组结构产生p60src蛋白质，靶蛋白磷酸化（二）细菌的特异位点重组沙门菌H片段倒位决定鞭毛相转变。鼠伤寒沙门氏菌有两相:Ⅰ相：由H1基因表达产生H1鞭毛蛋白Ⅱ相：由H2基因表达产生H2鞭毛蛋白两相细菌在进行细胞分裂时，以大约1/1000的频率产生另一相的后代，此过程称为相变（phasevariation）。相变的实质是Hl或H2基因选择性表达的结果H2鞭毛素阻遏蛋白Hin重组酶转位片段hinH2IH1H1鞭毛素hinH2IDNA启动序列H1启动序列沙门菌H片段倒位决定鞭毛相转变H抗原刺激机体后主要产生IgG，H抗原分析是沙门氏菌定型的依据。自然界中存在着数以百万计的各种抗原物质，若一种抗体分子特异性识别和结合一种抗原，体内如何产生这么多种类的抗体分子呢？抗体产生特异性免疫应答的重要分子机制就是免疫球蛋白（IG）的基因重排。免疫球蛋白的基因重排（三）免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链(L链)和两条重链(H链)组成，分别由三个独立的基因族编码，其中两个编码轻链(和)，一个编码重链。轻链的基因片段：重链的基因片段：LVJCLVDJC免疫球蛋白（Ig）的结构Ig由两条轻链(L链)和两条重链(H链)组成，分别由三个独立的基因族编码，其中两个编码轻链(和)，一个编码重链。人免疫球蛋白染色体定位编码的肽链基因符号染色体定位基因片段及排列组合数H链IgH14q32.3V65-D30-J6-C965×30×6＝11700κ链Igκ2p11-12V50-J5-C50×5＝250λ链Igλ22q11.2V50-100-(J-C)450×4＝200重链(IgH)基因的V-D-J重排和轻链(IgL)基因的V-J重排均发生在特异位点上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的两侧存在保守的重组信号序列(recombinationsignalsequence,RSS)。CACAGTG(NNNNNNN…)ACAAAAACCGTGTCAC(NNNNNNN…)TGTTTTTGGN:12/23bp7bp9bp切割位点重组酶识别位点此重排的重组酶共有两个，分别由基因rag1、2(recombinationactivatinggene)编码。RAG1：识别9bp信号序列。RAG2：结合于RAG1，并在7bp序列处切割。单链切开RAG1RAG2免疫球蛋白基因重排过程V片段J片段RSS间插DNARSSOHOHV片段J片段分子内转酯反应V片段J片段单链切开、转移核苷酸修复、连接V片段J片段CACAGTG(NNNNNNN…)ACAAAAACCGTGTCAC(NNNNNNN…)TGTTTTTGGN:12/23bp7bp9bp切割位点重组酶识别位点目录基因拼接过程中的转酯反应目录7nt切割位点9nt重组酶识别位点H重链L1V1LnVnD1-12J1-4CμCδL1V1LnVnJ1-4Cκκ轻链转录、加工AAA翻译新生多肽链成熟多肽链L1V1LnVnD2J1CμCδL1V1D2J1CμCδL1V1D2J1CμL1V1J1CκAAAL1V1J1Cκ组合成Ig分子小鼠Ig胚系基因片段和重链、κ轻链配对的多样性基因片段数可变区基因经重排和随机配对后多肽链VJ重组方式推算的多样性数目重链1000124V-D-J4.8×104κ轻链2504V-J1.0×103概念：由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座(transposition)。指DNA从一个位置移动到基因组上另一个位置。这些可移动的DNA序列包括：（一）插入序列(insertionsequences,IS)（二）转座子（transposons）四、转座重组插入序列(insertionsequences,IS)组成：IRTransposaseGeneIR（一）插入序列转座•二个分离的反向重复(invertedrepeats,IR)序列•特有的正向重复序列•一个转座酶（transposase)编码基因保守性转座(conservativetransposition)复制性转座(duplicativetransposition)保守性转座(conservativetransposition)复制性转座(duplicativetransposition)插入序列的复制性转座转座子(transposons)——可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。IRIRTransposaseGene有用基因（二）转座子转座转座子组成：反向重复序列转座酶编码基因抗生素抗性等有用的基因BarbaraMcClintock(1902-1992),Biologist.NobelPrizefordiscoveringjumpinggenesincorn---theninbacteriaandhumans.ColdSpringHarborLaboratory.细菌的可流动性元件A插入序列：转座酶编码基因两侧连接反向末端重复序列(箭头所示)B转座子Tn3：含有转座酶、β-内酰胺酶及阻遏蛋白编码基因C转座子Tn10：含四环素抗性基因及两个相同的插入序列IS10L由转座子介导的转座相关概念DNA克隆工具酶目的基因基因载体基本原理重组DNA技术与医学的关系主要内容：第二节DNA重组技术DNARecombinationTechnique一、重组DNA技术相关概念克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。（一）DNA克隆分子克隆：细胞克隆：动物克隆：克隆的不同层面应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细