核酸扩增技术

核酸扩增技术主要内容第一节聚合酶链反应技术第二节荧光定量PCR技术第三节其他核酸扩增技术第四节临床基因扩增实验室的管理与质量控制第一节聚合酶链反应技术POLYMERASECHAINREACTION,PCR一、PCR技术发展简史二、PCR技术原理三、PCR反应体系、条件及其优化四、扩增产物检测及分析五、PCR常见问题与原因分析六、PCR衍生技术PCR技术发展简史•1985年KaryMullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应，使用的DNA聚合酶是Klenow片段。•1986年RandallSaiki发现taqdna聚合酶，从此pcr技术得以广泛应用。(1993年诺贝尔化学奖获得者)基本原理PCR反应体系、条件及其优化•PCR反应体系•模板（Template）•引物（Primers）•DNA聚合酶(DNAPolymerase)•dNTP(ATP,CTP,TTP,GTP)•PCR缓冲液（PCRBuffer）•PCR反应条件•变性•退火•延伸•循环•DNA•RNA：总RNA、mRNA、tRNA、rRNA、病毒RNA基因组DNA质粒DNA模板（Template）引物(Primers)•引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。→←3’3’5’5’ForwardprimerReverseprimer引物的重要性•在整个PCR体系中,引物占有十分重要的地位。PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合，不与其他非目的DNA结合，PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸，可见引物设计好坏与PCR结果密切相关。引物设计总原则•引物与模板的序列要紧密互补•引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构•引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)引物设计一般原则引物长度•一般为15-30个核苷酸，常用的是18-24bp。在做长片段PCR或做某些特殊的PCR时应使用较长的引物，但最多不超过50个核苷酸•引物过短会引起错配现象，一般来说引物长度大于16bp是必要的（不容易引起错配）•较长的引物（28-35bp)一般是用来区分同源性较高的模板序列或者使用于产生一些突变位点碱基分布的均衡性•GC含量一般40-60%，推荐45-55%或50-60%上下游引物的GC含量不能相差太大。•GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性•GC含量太高也易于引发非特异扩增。•同一碱基连续出现不应超过5个引物Tm值•一般要求：55℃-65℃。•计算：•对于低于20个碱基的引物，TM值可根据TM=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算•对于较长引物，TM值则需要考虑热动力学参数，从“最近邻位”的计算方式得到，这也是现有的引物设计软件最常用的计算方式。•TM=△H/(△S+R*LN(C/4))+16.6LOG([K+]/(1+0.7[K+]))-273.15引物二级结构•引物二聚体•尽可能避免两个引物分子之间3’端有有较多碱基互补•发夹结构•尤其是要避免引物3’端形成发夹结构，否则将严重影响DNA聚合酶的延伸。引物3’端•引物的延伸从3’端开始，因此3’端的几个碱基与模板DNA均需严格配对，不能进行任何修饰，否则不能进行有效的延伸，甚至导致PCR扩增完全失败。考虑到密码子的简并性，引物3’端最后一个碱基最好不与密码子第三个碱基配对。引物3’端不要出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，否则会使错误引发机率增加。•引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。•引物5’端可以有与模板DNA不配对碱基，在5’端引入一段非模板依赖性序列。•5’端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位点5’端加上适当数量的保护碱基）•5’端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突变以作研究•5’端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）引物5’端引物的保守性与特异性•保守性：通用引物——检测同一类病原微生物尽可能多的型别•特异性：避免非特异性扩增扩增区域的二级结构•模板DNA的某些区域具有高度复杂的二级结构，在选择引物时，应使扩增区域尽可能避开这些区域。•扩增区域的自由能（△G。）小于58.61kj/mol•引物Tm值与PCR产物Tm值相差一般不超过30℃•TMPRODUCT=81.5+16.6LOG([K+]/(1+0.7[K+]))+0.41(%G+%C)-500/LENGTH(PRIMERPREMIER5.0)•TMPRODUCT=81.5+16.6(LOG10([NA+]))+0.41(%G+%C)-600/LENGTH(PRIMER3)引物与PCR•引物浓度：一般为0.1-0.5umol/l•引物浓度(um)=nod×33/（a×312＋c×288＋g×328＋t×303-61）/vh2ovh2o(单位：l)•退火温度•最适退火温度(Taopt)=0.3×(Tmofprimer)+0.7×(Tmofproduct)–25•一般采用较引物Tm值低5℃作为PCR退火温度引物设计软件•PRIMERPREMIER5.0•OLIGO•PRIMEREXPRESS•PRIMER3•METHPRIMERDNA聚合酶(DNAPolymerase)•特性：•热稳定性:92.5℃、95℃、97.5℃时，半衰期分别为130min、40min、5-6min•延伸效率:70-75℃时，1kb/min•校正功能:Taqdna聚合酶没有3’-5’外切酶活性，Vent、Pfu等具有3’-5’外切酶活性dNTP•dNTP：包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP。•浓度：0.2~0.5μM•dNTP会络合Mg2+，当PCR需要较高浓度的dNTP时，应在反应体系中适当增加Mg2+浓度。PCR缓冲液（PCRBuffer）•一般组成：50mMKCl,10-50mMTris-Cl(室温pH8.3)，1.5mMMgCl2•附加成分：牛血清白蛋白、明胶、非离子去污剂（如Tween20，浓度0.05%）二甲亚砜（DSMO）PCR一般方案——反应组成•50μlPCR反应体系的组成：•①样品DNA0.1~1μg；•②正、负链引物（10μM）各1.0μl；•③脱氧核苷三磷酸（dNTP各10μM）1.0μl•④10×PCR缓冲液5.0μl；•⑤MgCl2（25mM）3.0μl；•⑥TaqDNA聚合酶1~2.5U；•⑦蒸馏去离子水补至50μl，短暂离心混匀。阳性对照、空白对照分别以阳性模板DNA、蒸馏去离子水取代样品DNA。（举例）PCR一般方案——热循环PCR反应体系、条件的优化•三磷酸脱氧核苷酸•耐热DNA聚合酶•缓冲液•模板核酸•引物•Mg2+•变性温度•退火温度•延伸温度•循环数和扩增效率•降落PCR(TouchdownPCR)•热启动PCR（HotStartPCR）降落PCR(TOUCHDOWNPCR)•根据引物Tm值，选定一个退火温度范围（跨越10-20℃的温度范围，引物Tm值在这个范围之内）。在设置循环参数时，让退火温度从选定范围的最高温度开始，逐步降低退火温度（每次降低1℃），最后结束在选定范围的最低温度。在每一个退火温度上循环2-5次。•举例：如果一对引物的Tm值为60℃，可设置退火温度从63℃降低到48℃，每次降低1℃，每个退火温度循环两个周期，最后在48℃退火温度下做15个循环。热启动PCR（HOTSTARTPCR）•PCR反应体系中先不加TaqDNA聚合酶，等PCR扩增仪的温度上升到80℃以后再加TaqDNA聚合酶。•将石蜡珠在Eppendorf管中PCR反应液上面融化并凝固，在石蜡层上面加上TaqDNA聚合酶。在温度上升到变性温度时，石蜡融化，TaqDNA聚合酶进入反应体系，通过对流作用而混匀。•在PCR反应液中加入TaqDNA聚合酶的单克隆抗体，再加入TaqDNA聚合酶，在温度上升到将此抗体变性灭活前，抗体中和TaqDNA聚合酶活性，TaqDNA聚合酶对引物无法进行延伸。待温度上升到足够高时，抗体失活，扩增反应开始。扩增产物的检测及分析•凝胶电泳：•琼脂糖凝胶电泳法•聚丙烯酰胺凝胶电泳法•PCR-限制性片段长度多态性分析法（PCR-RFLP）•核酸探针杂交法•PCR产物测序琼脂糖凝胶电泳•制胶•加样•电泳•紫外光检测聚丙烯酰胺凝胶电泳•特点：•分辨力高，长度仅相差1BP的DNA分子即可分开；•回收的DNA纯度高；•采用银染色DNA或RNA，灵敏度高，比琼脂糖凝胶电泳中EB染色法高2-5倍，而且避免EB易退色的弱点。•用途：PCR扩增指纹图、多重PCR。PCR-RFLP(RESTRICTIONFRAGMENTLENGTHPOLYMORPHISM)•据目的基因序列可查出所包含的酶切位点，用相应的限制性核酸内切酶消化PCR扩增产物，然后进行电泳，观察消化片段的大小是否与序列资料相符。•用途：•传染病病原体基因分型•人类基因的变异性研究。核酸探针杂交法•点杂交•反向点杂交•微孔板杂交•荧光探针杂交法点杂交（DOTBLOT）•原理：将扩增产物变性后直接点在尼龙膜或硝酸纤维素膜上，再用放射性或非放射性标记物标记的寡核苷酸探针与之杂交。•探针：•放射性同位素标记探针检测的敏感、特异，具有不稳定性和放射性危害。•非放射性物质（如生物素、地高辛、荧光素等）标记的探针稳定性高、使用安全、检测速度快•用途：主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。反向点杂交(REVERSEDOTBLOT)•原理：使用带有标记物的引物进行PCR扩增，然后将扩增产物变性。将不同的寡核酸探针固定在尼龙膜上，用变性的PCR产物与之杂交。•探针：严格设计，具有相同的杂交反应条件。•用途：反向点杂交特别适用于遗传性疾病多个位点的点突变分析。•结果分析：•正常纯合子•突变纯合子•杂合子荧光探针杂交法•目前临床上常用荧光探针法来检测PCR产物，主要的方法有TAQMAN技术、分子信标技术、复合探针法等。PCR产物测序•对PCR产物进行测序是检测PCR产物特异性最可靠的方法，可将PCR产物克隆到载体上进行测序，也可对直接PCR产物进行测序。常见问题原因分析及处理•假阳性•非特异性PCR产物•假阴性•引物二聚体假阳性•PCR产物是最主要的污染源。•含有靶DNA序列的质粒的污染。•阳性对照的污染。•标本之间的交叉污染。•TAQ聚合酶中带有细菌DNA，当PCR扩增片段为保守的RRNA序列时，易造成假阳性。非特异性PCR产物•引物特异性不高，引物用量过多，应调换引物或降低引物用量。•TAQDNA聚合酶质量不好或用量偏高，应降低酶量或使用质量较好的酶。•MG2+浓度过高，可适当调节MG2+浓度。•退火温度过低，退火及延伸时间偏长，可提高退火温度，减少退火及延伸时间，或者采用二温循环PCR进行扩增。•热循环次数过多，适当增加模板用量，减少循环次数。假阴性•引物设计是否合理•标本中是否有TAQ酶抑制剂，TAQ酶是否失活。•反应体系中有无蛋白酶或核酸酶降解DNA聚合酶或模板DNA，可在95℃以上加热10分钟使其灭活。•反应体系中是否有较难去除的蛋白质抑制PCR系统，用蛋白酶K重新处理常可获预期结果。•循环温度，特别是解链温度是否准确，退火温度是否过高。有些PCR仪指示温度与实际温度不符，过高则酶在前几个循环中迅速失活，过低则模板变性不彻底•检测PCR产物方法灵敏度不够，如琼脂糖凝胶电泳法敏感性较低。•靶序列发生突变、缺失等引物二聚体两个相同的或不同的引物分子之间有较多的碱基配对，特别是引物3’端有互补区。引物模板比例太高，可增加模板用量。退火温度过低。热循环次数过多。•PCR污染及预防措施•分开操作区域。•耐高压的试剂及器材应高温高压灭菌。•使用一次性TIP头、EPPENDORF管等。•小量分装试剂。•样品制备应按无菌操作原则进行，避免样品间相互污染。•操作者带手套