第七章细菌和噬菌体的重组和连锁

第七章细菌和噬菌体的重组和连锁基本知识细菌是单细胞，它的遗传物质是一个大型的环状核酸分子，称之为基因带，也可称为染色体。若细菌丧失产生某种营养物质（如氨基酸）的能力就称为营养缺陷型，相对于缺陷型的野生菌株叫原养型。病毒的结构是由蛋白质外壳和包裹在中间的一个单一的核酸分子（可称基因带或染色体）组成。例如：细菌的基因组Onecircularchromosome(4-5Mb)原养型及营养缺陷型鉴别:基因型的表示：用它们不能合成的物质的前三个字母7.1细菌的遗传分析细菌的杂交以大肠杆菌为例，大肠杆菌K12中两个菌株A和B，菌株A是供体，含有F因子（F质粒），记作F+，菌株B是受体，没有F因子，记作F-。F因子又称性因子或致育因子，它是能独立增殖的环状DNA分子。F+细菌的表面有称作性伞毛的细长纤毛。当F+细菌与F-细菌结合时，F因子通过性伞毛从F+细菌转移到F-细菌，原来的细菌还仍为F+。不过染色体很少通过结合而转移到F-细菌，所以染色体上的基因的重组频率很低。细菌接合杂交实验Lederberg和Tatum1946A＋B－×A－B＋A＋B＋回复突变or重组？？？细菌接合杂交实验Lederberg和Tatum1946A＋B＋C－D－×A－B－C＋D＋A＋B＋C＋D＋A品系：met－bio－thi＋leu＋thr＋（thi：硫胺素B1）B品系：met＋bio＋thi－leu－thr－AA+BB基本培养基met＋bio＋thi＋leu＋thr＋出现频率:1/107细菌接合（示：杂交实验）达尔夫DavisU型管实验细菌接合遗传物质的单方向转移Hayes实验A:met-thr+leu+thi+B:met+thr-leu-thi-Donor：AReceptor：B大剂量链霉素A品系无影响大剂量链霉素B品系阻止了重组F因子（F质粒）F质粒与细菌接合F因子特点•F＋细菌可以把F因子传给后代。•F＋细菌经吖啶橙处理F因子丢失，丢失后不再出现。•F＋可以和F－杂交，而不能和F＋杂交。•F＋和F－杂交后代皆为F＋，而且可以以10－7频率获得重组体后代。Hfr菌株因为F因子和细菌的DNA分子都是环状的，在环状的细菌染色体和环状的F因子间通过一个交换，环状F因子就整合到环状的细菌染色体上。F因子整合到细菌染色体上的菌株就是高频重组菌株，称为Hfr菌株。高频重组菌株（Hfr菌株）跟菌株B（F-）杂交时，细菌染色体上基因的重组频率很高，即出现重组子的频率很高。Highfrequencerecombination（图示F因子整合到细菌染色体的过程）Hfr与F-的接合（示：细菌的交换过程）Hfr品系与F＋菌株的区别•相同1、都能和F－杂交。2、杂交都要通过接合管和受体菌相联接。3、高剂量链霉素处理后都不影响杂交，说明它们都是作为一种供体。•不同1、产生重组子频率不同，Hfr×F－为10－4，F＋×F－为10－7。2、F＋×F－后代F＋，Hfr×F－后代F－。3、F＋细菌经吖啶橙处理变成F－，Hfr经吖啶橙处理仍为Hfr。中断杂交技术：把Hfr细菌与F-细菌混合培养，每隔一定时间取样，将试样搅拌并稀释后在选择培养基上培养，使其只有重组子类型可以生长，分析Hfr染色体上基因进入受体细胞（F-细菌）的顺序各所需时间（分钟），这种根据供体基因进入受体细胞的顺序和时间绘制连锁图的技术，称为中断杂交技术。中断杂交实验巴斯德实验室，ElieWolliman和FrancoisJacob（1）.Wollman和Jacob的实验–要解决的问题是：•Hfr细菌在交配中，什么时候把基因转移给F－细菌。•方法：把两个菌株混在一起，进行杂交将二菌株在培养液中通气培养，Hfr细菌与F－细菌开始接触，形成接合管。每隔一定时间取样搅拌，断开结合管，使配对的细菌分开。然后稀释菌液，防止再度配对。将上述菌液涂布在含有链霉素，但不含有苏氨酸和亮氨酸的培养基上。这样，带thr+和leu+的Hfr菌株对链霉素敏感；而带有strr的F－菌不能合成苏氨酸和亮氨酸，都不能生长。只有带thr+和leu+的Hfr菌和带有strr的F－菌的重组子可以生长。•把中断杂交的细菌放在完全培养基上培养，显然供体、受体菌都能生长。影响检测。我们只需要把发生重组的重组子检出。这就必须有一个可供选择用的供体标记基因。这样可以认出重组子，如在基本培养基中培养选择thr+leu+重组子。这时thr+leu+为标记基因，可排除受体菌株，但供体菌还能继续存在。为了不选择供体细胞本身，供体细菌也应该带有一个特殊的标记，能使自己不被选择。例如供体菌对链霉素敏感，这样当结合体在含有链霉素的培养基上生长时，供体菌株就被杀死了。如何检出某一基因的重组子?•把中断杂交的细菌稀释接种到含有链霉素的基本培养基上，如能形成菌落，它的基因型必定是thr+leu+strr。因为只有这种重组子才能生长。并说明供体thr+和leu+已进入受体并发生重组。我们称在供体菌中被选择的基因thr+和leu+为选择标记基因，而始终不被选择的strs为反选择标记基因，而那些还没有进行选择检定的基因为非选择标记。对每一时刻的重组thr+leu+strr的菌落影印培养接种到不同的培养基上（如乳糖lae++伊红+美兰→红色，反之则是粉红色的。记录重组子中每一非选择标记出现的时间、出现的频率和持续时间，得图（Hfr的非选择标记基因进入F-所需的时间，以及根据非选择标记在各个时间出现的频率作图）。在发生重组的菌落中，如何检别非选择标记基因各培养基分别具有不同的营养缺陷或某种抑制性物质存在。•Wollman和Jacob对重组子thr+leu+strr进行菌落影印培养实验。分析Hfr染色体上其它非选择性标记基因进入F－细菌的顺序和所需时间（分钟），绘制连锁图。（2）.实验结果及分析9从Hfr菌株某基因在F－细菌中出现开始，随着时间的推移，具有该基因的菌落逐渐增加，直到某一百分数为止。而且某一基因出现的时间愈早，它达到的频率愈高。如叠氮化钠抗性基因出现最早，在24分钟时就达到大约90％的F-菌落；半乳糖发酵基因出现最迟，即使在混和后60分钟也只有30％的菌落属于能利用型。（3）.结论染色体从一端开始，（这一端称为原点（origin）或O），以线性方式进入F-细胞中。基因离原点越远，进入F－细胞越迟。离开原点较远的基因，可能在转移过程停止以前，仍未转移，因而斜率较低，达到的最高值也较小。如果让Hfr×F－杂交继续进行，长达二小时，然后使之中断，这样发现某些F－受体转变为Hfr。致育因子是最后转移到受体的，并使它们成为供体其效率很低，是因为致育因子是线性染色体最后一个单位，它最晚进入F－细胞。（4）.作图Wollman和Jacob认为，根据中断杂交技术，用杂交后Hfr基因最初在受体细菌中出现的时间作为指标，可以作连锁图。–遗传距离用时间（分钟）为单位，譬如，ton在azi开始进入F－细胞后2分钟进入，那么azi和ton间的遗传距离为2单位，其它依此类推。细菌的交换过程重组子(即重组类型)的产生是由于不同的DNA分子之间发生交换的结果。细菌重组子的产生是由于细菌染色体（F-染色体）与供体DNA分子（部分Hfr染色体）之间发生交换的结果。但发生单交换是没有用的，只有发生偶数的交换才能产生有活性的重组子。根据重组子频率来确定两基因之间的距离并绘制出连锁图，这种根据重组频率作图的方法称之为重组作图。ABbabaABABbaABba+ABba部分二倍体图示：细菌基因的交换Hfrlac+ade+(strs)×F-lac-ade-(strr)完全培养基混合培养基本培养基（F-ade+菌落）（无腺嘌呤、加链霉素)EMB培养基（影印培养）F-ade+lac-基因间发生交换F-ade+lac+基因间未发生交换加乳糖实验方法：将重组子菌落影印培养在加有曙红和美蓝的培养基上：以检验能否利用乳糖。如能发酵乳糖（lac+），菌落是紫红色的。如不能利用（lac-），菌落是粉红色的。试验结果：亲组合52重组合15计算重组频率：重组菌落数/总菌落数×100%=(lac-ade+)/[(lac+ade+)+(lac-ade+)]×100%=15/(52+15)×100%≈20%已知中断杂交实验该两个基因相距1分钟,重组作图与中断杂交作图的图距关系:1分钟图距≈20%重组值前面提到，时间单位接近2分钟时，测得的基因间的距离，不太可靠，故应采用比较稳定的重组作图法。Ecoli染色体全长：90分钟；含有：3.6X106bp20×90≈1800cM三点测交绘制基因图谱F因子（F质粒）是带有部分细菌染色体的F因子。Hfr通过交换，可以形成带有部分细菌染色体的F因子，而F因子又可通过交换整合到细菌染色体上的原来位置，回复到以前的Hfr状态。F因子连同它所带有的部分细菌染色体可一起转移到F-细胞，并形成部分二倍体。这一特性叫做性导。F因子转移到F-细胞的转移速率近于F因子。但它把细菌染色体转移过去的效率比Hfr低得多。不过Hfr的致育因子（F因子）极少进入F-细胞。F质粒F和F因子•F品系转变成Hfr品系的频率要高于F＋品系。•F变成Hfr时F因子整合到相同位点上，而F＋变成Hfr时可整合到不同位点。•F×F－高频传递特定的基因，形成部分二倍体，而F＋×F－产生F＋但不转移任何基因，或以10－7将宿主的基因转移，所转移的基因是不同的。•Hfr×F－将宿主的基因按顺序转入受体，产生重组子频率较高，为10－４。但受体仍为F－（？）。性别细菌状态F因子状态♀F-无F因子♂F+F因子为游离状态♂HfrF因子整合到宿主染色体上♂F带有部分宿主染色体的F因子，为游离状态小结：1、细菌细胞的两种性别、四种状态：F+F-丢失杂交F+Hfr整合到E.coli染色体规则脱离E.coli染色体F'Hfr回复到Hfr染色体不规则脱离E.coli染色体2、F+、F-、Hfr、F'的关系转变关系F+×F-低频重组Hfr×F-高频重组F′×F-一般为低频重组，但对所携带的基因是高频重组。重组频率区别F＋，Hfr，F的接合对照利用Hfr菌株，根据中断杂交试验和基因重组试验及其它基因定位试验的结果，已绘制出的E.coliK12的环状染色体图。7.2噬菌体的遗传分析烈性噬菌体：噬菌体侵染细菌后，把宿主菌的生物合成装置接收过来，合成更多的噬菌体，最后使细菌细胞烈解并释放出很多子代噬菌体。这种使宿主菌烈解的噬菌体叫烈性噬菌体。如T2噬菌体。温和噬菌体：噬菌体侵染细菌后，细菌好象未被感染一样能继续增殖。如不经诱导宿主菌不发生烈解，这种噬菌体叫温和噬菌体。这种现象叫溶源性，这样的细菌叫溶源性细菌或溶源菌。如P22、P1和λ噬菌体。噬菌体的繁殖噬菌斑的鉴定（噬菌体遗传特性的鉴定）一个噬菌斑中的噬菌体在遗传上是均一的，相当于一个克隆。由于噬菌体的基因型不同，噬菌斑可以是大的或小的，边缘清晰的或模糊的；另外噬菌体的宿主范围（hostrange）也可能不同，有些噬菌体可以侵染和裂解某些细菌但不能侵染和裂解另外一些细菌，根据这些就可以鉴定噬菌体遗传特性。T2突变型的两点测交•T2突变型r-：快速溶菌，大界限分明噬菌斑•野生型r+：缓慢溶菌，小溶菌斑•寄主范围突变型h-：能感染E.Coil品系1、品系2。感染E.Coil品系1、品系2共培养，透明噬菌斑•野生型h+：只能感染E.Coil品系1。感染E.Coil品系1、品系2共培养，半透明噬菌斑T2突变型的两点测交重组值＝[(h+r+)+(h-r-)]/噬菌斑总数×100％h+r-×h-r+感染品系1子代检测重组感染品系1、2r-：大界限分明，r+：小；h-：透明，h+：半透明溶源性的遗传基础细菌的溶源性可以一代代传下去，是因为细菌细胞内含有无感染能力的噬菌体（称之为原噬菌体，prophage）。溶源菌中的原噬菌体可以以游离形式存在细菌细胞中，也可以整合到细菌染色体上，到底以哪一种形式存在，要视噬菌体的种类而定，P1以游离状态存在，而λ以及ф80，μ等以整合状态存在。但只要细菌