第八章DNA重组与转座

DNA重组与转座概述第一节同源重组第二节位点专一性重组第三节转座作用第四节逆转录转座子概述：◘只要有DNA，就会发生重组减数分裂高等Euk.体细胞核基因、叶绿体和线粒体温和噬菌体转座子转座◘生存→变异→突变，重组损伤修复、适应环境、加速进化◘广义遗传重组：任何造成基因型变化的基因交流过程DNA重组—DNA分子内或分子间发生遗传信息的重新组合。（1）同源重组（2）位点特异性重组（3）转座重组（4）异常重组◘DNA重组可分为四类（DNA序列、蛋白质因子）◘重组DNA技术第一节同源重组1、同源重组（homologousrecombination）:发生在同源DNA序列之间一、特征2、特征：◘涉及同源序列间的联会配对，且交换的片段较大◘涉及DNA分子在特定的交换位点发生断裂和错接的生化过程异源双链区的生成◘存在重组热点◘需要重组酶◘单链DNA分子或单链DNA末端是交换发生的重要信号细线期合线期粗线期双线期终变期◘e.g.Euk.减数分裂时的染色单体之间的交换细菌的转化，转导，接合，噬菌体重组双倍体染色体交换二同源重组的分子模型1.Holliday于1964年提出Holliday模型（1）两个同源染色体DNA排列整齐（2）两DNA分子同一部位两单链发生断裂引发重组（3）断裂的单链游离末端彼此交换形成Holliday中间体（4）通过分支迁移产生异源双链DNA分子。（5）中间体在内切酶和连接酶作用下，形成拼接重组体和片段重组体。SynapsedchromatidsRecombinationjointHeteroduplexDNA5‘5‘（1）（2）片段重组体拼接重组体Holliday中间体3‘5‘5‘3‘Meselson-Radding模型单链入侵模型（链转移模型）置换侵入Loop切除同化异构化分支迁移5’切割双链断裂修复模型2、分枝迁移和Holliday中间体结构的拆分◘分枝迁移（branchmigaration）－－双螺旋形成的交叉连接以拉链式效应扩散Holliday的异构化产生重组体的拆分Holliday结构一经生成即可不断地处于异构化－－异源双链heteroduplexDNA重组结果取决于拆分时配对链上的切口位置（1）（2）（1）（2）◘Holliday结构的拆分产生含异源双链的片段重组体产生拼接重组体“亲本链-片段重组体”“拼接重组体”三、原核同源重组（E.coli）◘发生在双方DNA的同源区域部分复制的染色体DNA之间或染色体DNA与外源DNA之间细菌的转化、结合和转导1、RecBCD酶和Chi位点◘RecBCD酶具有ATP依赖的解旋酶活性、依赖于ATP的核酸外切酶活性、序列特异性的单链内切酶活性.◘单链内切酶活性和解旋酶活性使DNA产生具有游离末端的单链－－－RecA的作用位点◘Chi位点含有GCTGGTGG序列,是基因recBCD编码RecBCD酶作用的靶位点3‘◘RecBCD的识别和切割位点a、RecBCD结合在DNA的平头末端（产生机制不清楚）b、外切、解链、移动（ATP）c、兔耳状loop结构产生（再旋酶活性低于解旋酶活性）d、RecBCD在loop单链区的chi位点3‘方4～6NT处切断单链（单链内切酶）☀chi位点：GCTGGTGG目前发现的重组热点E.coli含1000个、Euk.e、RecBCD切割产生3’单链末端2、RecA蛋白（1）活性a、RecA有单、双链DNA结合活性b、RecA有NTPase活性（底物差异活性）与单链DNA结合时活性最大---依赖于DNAc、RecA有启动一个分子的单链侵入到另一双螺旋分子的能力，即联会同源DNA（但其靶DNA必须有缺口－－结合DNA）RecA入侵单链被置换连RecA引发链侵入模型RecApromotestheassimilationofinvadingsinglestrandsintoduplexDNAsolongasoneofthereactingstrandshasafreeend.RecA启动的单链入侵RecA引起的链交换和Holliday结构的生成（2）RecA蛋白催化双链和单链DNA的反应阶段a、联会前阶段（缓慢）RecA与单链结合b、单链与双螺旋的互补链迅速配对，形成双链连接分子Holliday（5‘侵入）c、从双螺旋结构中缓慢置换一条链产生一段长的异源双链DNA反应结束时，RecA结合到双链上◘其中—单链同化有固定的方向入侵单链为5’－3‘双链DNA的互补链是3’－5‘◘RecBCD和RecA的共同作用3、原核同源重组的其它蛋白需要E.coli中三个基因ruvA,ruvB和ruvC的产物a、RuvA识别Holliday结构的连接点b、RuvB为分枝迁移提供动力（ATPase10～20bp/s）c、RuvC核酸内切酶---专一性识别Holliday结构的连接点体外切段连接点以拆分重组体◘E.coli重组的各阶段（损伤修复）损伤DNA复制产生缺口RecA链交换第二次链交换DNApol通过DNA合成填满缺口RuvA,B分枝迁移RuvC切割Holliday连接点第二节位点专一性重组一、位点专一性重组（site-specificrecombination）1、概念：发生在专一序列的DNA分子间的重组,有特异的重组酶和辅助因子对其识别和作用。噬菌体基因组整合到细菌染色体基因组中属此种重组2、位点特异性重组的结果依赖于重组位点的位置和方向二、λphage的整合与切除1、实现机制：均是通过---细菌DNA和λDNA上特定位点之间的重组2、特定位点-----附着位点（attachmentsiteatt）◘E.coliattB含BOB’序列23bp◘λphageattP含POP’序列240bp◘核心序列“O区”完全一致（同源部分15bp）---位点特异性重组发生的地方3、整合过程◘整合后的附着位点为attL（BOP’）attR（POB’）◘整合位点---attB、attP切除位点---attL、attR◘整合过程需要λ整合酶（integraseInt）（λ编码）和寄主的整合宿主因子IHF（integrationhostfactor）共同作用溶源性细菌(lysogen)溶菌周期（lysis）原噬菌体4、整合分子机制◘核心序列O全长15bp，富含A-T◘发生在O内的重组交换位点相距7bp◘整合酶的结合位点：attP240bp、attB23bp(两者的作用不同)◘attP位点的负超螺旋为重组所必须---加强了Int和IHF的亲和力-----高剂量的蛋白维持单链重组所必需的结构◘Int结合----核心序列的反向位点（切割位置）----结合在att臂上（臂与核心区靠近）intIHFXis◘整合体及其作用整合体（intasome）---Int和IHF结合到attP时的复合物◘整合体捕获attB说明-----a、attB和attP的最初识别靠Int识别两序列的能力b、两序列的同源性在链交换时为重要因素◘Int蛋白能切断DNA，并使它重新连接，近而使holliday结构拆分◘重组时attP和attB部位交叉断裂，互补单链末端进行交叉杂交5、整合与切除的控制（1）整合◘CⅡ---促使阻遏蛋白CⅠ的产生---与intgene的PI结合，转录产生Int蛋白---且PI位于xis基因内，CⅡ与PI结合导致xisgene失活（2）切除◘寄主SOS反应时---RecA大量产生，促使阻遏蛋白CⅠ的水解---把OL和OR从阻遏状态释放出来---从PL转录使int和xis表达细菌的特异位点重组——鼠伤寒沙门氏杆菌鞭毛蛋白H1和H2转换四、依赖于同源重组的位点特异性的序列代换-----酵母MAT序列的转换1、酵母结合型的转变---DNA序列的代换，而不是互换---依赖于序列的同源性（被代换的序列命运是被降解---突变试验）2、同源序列匣子WXYZ1Z2totalHML723704747239882501MAT723704747239882501MATa723704642239882369HMRa7046422398815853、转换过程◘内切酶(HO)识别、切割--Y/Z1交界处---起始MAT序列的转换(双链断裂)［HM匣子受Sir阻遏蛋白的保护］①◘Y区域被降解，直到Yα和Ya相同的部分或一直到X区域①②◘四个断头侵入供体匣子的同源部分并与其中互补链配对◘以供体DNA为模板复制Y区域，holliday结构形成③④◘Holliday结构的拆分，产生新的MAT匣子和这次转换中的供体匣子4、特征---同源重组和位点特异性重组特征都具有◘需要大范围的同源序列◘需要重组酶系（rad52基因产物、位点特异性的HO内切酶）第三节转座作用一、转座子概述1、转座子(元)或转座元件(transposonortransposableelement):基因组上不必借助于同源序列就可以移动的DNA片段，它们可以直接从基因组的一个位点移到另一个位点（供体和受体）转座（transposition）：转座子的转移过程2、发现和发展◘1914A.Emerson1936Marcus.M.Rhoabes玉米果皮、糊粉层花斑突变玉米籽粒糊粉层色素不稳定遗传机理跳跃基因（jumpinggene）◘1947冷泉港实验室（美）BarbaraMcClintock◘基因转座现象的再次发现与证实在一个操纵子中，与操纵基因毗连的结构基因发生终止突变后，它除了影响该基因本身产物的翻译外，还影响其后结构基因多肽的翻译，并且具有极性梯度的特征。插入型极性突变的发现与机理Operon&PolarityMutation极性突变的基本概念A酶活性OgeneZ基因终止突变位点离O基因的距离IpoZYA20世纪60年代末期,在不同实验室发现一系列可转移的抗药性转座子1983年BarbaraMcClintock被授予诺贝尔生理学与医学奖。a)不依赖供体序列与靶位点间序列的同源性b)转座不是简单的转移，涉及转座子的复制Hotspots(热点)Regionalpreference(在3kb区域内的随机插入)d)某些转座因子（Tn3）对同类转座因子的插入具有排他性（免疫性）e)靶序列在转座因子两侧会形成正向重复f)转座因子的切除与转座将产生复杂的遗传学效应3、转座重组的特点c)转座插入的靶位点并非完全随机（插入专一型）二、Prok.转座子种类◘两种类型：简单转座子（simpletransposon）（插入序列insertionsequenceIS）复合转座子（compositetransposon）◘共同特征：a）两端有20～40bp的IRb）具有编码转座酶（transposase）的基因1、插入序列◘最简单，是细菌染色体、质粒和某些噬菌体的正常组分◘命名：IS＋编号（鉴定类型）长度700～2000bp◘特点：a）两端IR为转座酶的识别位点（突变）b）插入靶位点后会出现靶位点的正向重复（3～9bp）◘IS可以正反方向插入到DNA（宿主、质粒或某些噬菌体），常对插入位点后面的基因表达功能产生极性效应a)Tn/TnAfamilyl具有IR、转座酶基因、调节基因（解离酶）、抗抗生素基因lTn1(AmpR)Tn2(AmpR)Tn3(AmpR)Tn4(AmpRStrR)Tn5(KanR)Tn6(kanR)Tn7(StrRTmpR)Tn9(CamR)Tn10(TetR)2.5kb20kbTn3IRTnpAResTnpRAmpRIR38bp38bp转座酶regulatorβ-内酰胺酶2、复合转座子◘两种类型b）两端重复序列为IS的复合转座子e.g.IS插入到功能基因两端，可能形成复合转座因子ISISISISLISR臂中心区臂transposition◘当两个IS组件相同时，其中任一个都可行使转座功能◘不同时，主要依靠一个◘两侧的IS既可以是IR，又可以是DR状态（IR多）3转座噬菌体Muphage（巨型转座子）CrepressorforA,BB33kd与转座有关A70kd转座酶U,S毒性蛋白attL,attR与寄主同源，反向重复，转座必需GinG区倒位酶attLCABS