国家自然科学基金标书

申请代码：C160102受理部门：收件日期：受理编号：国家自然科学基金国家自然科学基金国家自然科学基金国家自然科学基金申申申申请请请请书书书书(2008(2008(2008(2008版版版版))))资助类别：面上项目亚类说明：附注说明：项目名称：检测NPM基因突变并探讨NPM对白血病细胞生物学特性的影响申请者：张伶电话：[phone]依托单位：重庆医科大学通讯地址：重庆医科大学临床检验诊断学教育部重点实验室邮政编码：400016单位电话：[phone]电子邮件：[e-mail]申报日期：2008年3月12日国家自然科学基金委员会国家自然科学基金申请书2008版第2页版本1.003.844基本信息基本信息基本信息基本信息zYleU7IM姓名张张伶性别女出生年月1970年1月民族汉族学位博士职称副教授主要研究领域临床血液学与检验电话[phone]电子邮件[e-mail]传真个人网页工作单位重庆医科大学/医学检验系申申申申请请请请者者者者信信信信息息息息在研项目批准号名称重重庆医科大学代码63004601联系人袁军电子邮件[e-mail]依托单位信息依托单位信息依托单位信息依托单位信息电话[phone]网站地址合作单位信息合作单位信息合作单位信息合作单位信息[项目名称检检测NPM基因突变并探讨NPM对白血病细胞生物学特性的影响资助类别面上项目亚类说明附注说明申请代码C160102:检验医学C140402:血液与淋巴系统疾病基地类别2005-56:临床检验诊断学教育部重点实验室\部门开放预计研究年限2009年1月—2011年12月研究属性应用基础研究项项项项目目目目基基基基本本本本信信信信息息息息申请经费32.5000万元摘摘摘摘要要要要((((限限限限400400400400字字字字))))：：：：最近国内外文献报道近三分之一的急性髓系白血病患者可发生核仁磷酸蛋白（NPM）基因突变及NPM蛋白胞浆移位，提出一种新的白血病亚群（NPMc+AML）。它的出现有助于完善白血病的WHO分型、预后判断和微量残留病监测，因此迫切需要建立适合临床的NPM突变检测方法，并进一步阐明NPM突变在白血病发病中的作用机制。本项目首先采用PCR技术在分子水平上检测NPM基因突变，同时利用荧光标记自制的突变型NPM蛋白单抗在细胞水平上检测胞浆蛋白；然后通过转染将携NPM突变基因或者NPM基因RNA干扰片段的病毒重组体导入白血病细胞系中，采用软琼脂克隆形成实验、FCM、RT-PCR和滤膜小室法等方法检测靶细胞增殖潜能、周期分布、凋亡特性和趋化性的改变，观察NPM突变对白血病细胞生物学特性的影响。本研究将推动NPM突变这项新指标在临床血液学检验的广泛应用，同时也有助于了解NPM基因突变在白血病发病中的分子机制。关关关关键键键键词词词词(用分号分开，最多5个)核仁磷酸蛋白，基因突变，白血病，检测，分子机制国家自然科学基金申请书2008版第3页版本1.003.844项目组主要项目组主要项目组主要项目组主要成员成员成员成员（注:项目组主要成员不包括项目申请者，国家杰出青年科学基金类项目不填写此栏。）编号姓名出生年月性别职称学位单位名称电话电子邮件项目分工每年工作时间（月）1王王利1973-3-24女主治医师博士[e-mail]课题指导和临床支持62陈陈辉1970-3-5男副教授博士重庆医科大学[e-mail]检测方法学评价53骆骆展鹏1978-1-14男硕士生其他重庆医科大学[e-mail]检测NPM突基因表达104何何鹏1978-4-27男硕士生其他重庆医科大学[e-mail]病毒载体构建及转染105钟钟晓明1975-6-16男硕士生学士重庆医科大学[e-mail]单抗制备及免疫学检测106杨杨松1978-9-5男硕士生学士重庆医科大学[e-mail]检测和趋化实验107王王箭1969-11-23男实验师其他重庆医科大学[e-mail]实验技术指导88高高玉洁1985-2-14女硕士生学士重庆医科大学[e-mail]细胞生物学特性检测109[总人数高级中级初级博士后博士生硕士生9225说明:高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请者负责填报（含申请者），总人数自动生成。国家自然科学基金申请书2008版第4页版本1.003.844经费申请表经费申请表经费申请表经费申请表（金额单位：万元）科目申请经费备注（计算依据与说明）一一一一....研究经费研究经费研究经费研究经费26.8750占申请经费的83％，符合基金委≥65％的规定。1.科研业务费4.2000（1）测试/计算/分析费2.0000FCM检测细胞周期、转染目的基因的表达以及凋亡。（2）能源/动力费0.8000细胞培养用CO2气体等。（3）会议费/差旅费0.7000参加国内学术交流。（4）出版物/文献/信息传播费0.7000文献查新和上网费等。（5）其它0.00002.实验材料费21.4750购买实验相关试剂和耗材。（1）原材料/试剂/药品购置费20.5000购买病毒载体、多种抗体、购买两种白血病细胞系，体外实验相关试剂等。（2）其它0.9750实验耗材等。3.仪器设备费0.0000（1）购置（2）试制4.实验室改装费5.协作费1.2000科研协作。二二二二....国际合作国际合作国际合作国际合作与交流费与交流费与交流费与交流费1.5000参加国际学术会议，符合基金委≤15％的规定。1.项目组成员出国合作交流1.50002.境外专家来华合作交流三三三三....劳务费劳务费劳务费劳务费2.5000用于支付研究生和临时佣工的劳务费（共3年），在基金委规定的15％范围内。四四四四....管理费管理费管理费管理费1.6250占申请经费的5％，符合基金委≤5％的规定。合合合合计计计计32.5000国家其他计划资助经费其他经费资助（含部门匹配）10.0000与本项目相关的其他经费来源其他经费来源合计其他经费来源合计其他经费来源合计其他经费来源合计10.0000国家自然科学基金申请书2008版第5页版本1.003.844报告正文报告正文报告正文报告正文((((一一一一))))立项依据与研究内容立项依据与研究内容立项依据与研究内容立项依据与研究内容1.1.1.1.项目的立项依据项目的立项依据项目的立项依据项目的立项依据1.临床上白血病分型和微量残留病监测面临的困境临床上白血病分型和微量残留病监测面临的困境临床上白血病分型和微量残留病监测面临的困境临床上白血病分型和微量残留病监测面临的困境白血病是血液系统的恶性克隆性疾病，正确的诊断及分型对指导治疗和判断预后至关重要。传统的FAB分型主要是以形态学为基础，但由于白血病细胞的高度异质性和多态性，容易受主观因素的影响。1999年世界卫生组织(WHO)提出了急性髓系白血病(acutemyeloblasticleukemia，AML)的分型新标准，要求运用形态学、免疫学、细胞遗传学、分子生物学等资料对白血病进行诊断分型，相对于主要依赖形态学进行诊断的FAB标准而言是一个重大的进步。WHO分型强调细胞遗传学和基因异常对于分型及判断预后的重要作用，临床上接近一半的AML患者可以通过WHO分型结果指导治疗和判断预后。然而，还有一半的患者被笼统定义为““““无明无明无明无明显特征的显特征的显特征的显特征的AMLAMLAMLAML””””，，，，其中包括染色体核型正常的患者，这类患者在分子学水平上其实是具有异质性的，目前尚没有一个特异的指标目前尚没有一个特异的指标目前尚没有一个特异的指标目前尚没有一个特异的指标来明确限定此群体来明确限定此群体来明确限定此群体来明确限定此群体[1]。因此，寻找这类AML在分子遗传学上的共同改变，进一步完善WHO分型标准是白血病诊断研究的重点。微量残留病(minimalresidualdisease,MRD)被认为是白血病复发的主要根源，动态监测MRD协助治疗是白血病检验的重要内容。目前MRD监测指标大多是各型AML对应的不同融合基因，缺乏通用的白血病MRD监测指标，且大部分核型正常的AML更无可供选择的基因改变。最近研究发现近三分之一的成人成人成人成人AMLAMLAMLAML患者出患者出患者出患者出现特异性的核仁磷酸现特异性的核仁磷酸现特异性的核仁磷酸现特异性的核仁磷酸蛋白蛋白蛋白蛋白（（（（nucleophosmin,NPM））））突变突变突变突变，这一发现立即引起了国内外检验工作者和白血病研究者的极大兴趣。2.AML患者发生患者发生患者发生患者发生NPM基因突变的临床意义基因突变的临床意义基因突变的临床意义基因突变的临床意义NPM基因位于染色体5q35，编码含有12个外显子的核仁磷酸蛋白。正常情况下NPM蛋白主要定位于核仁颗粒区，可穿梭于核仁、核质和胞质之间，参与核糖体合成和中心体复制，调控细胞周期进程以及细胞凋亡。NPM蛋白在调控血细胞发育过程中起重要作用，能够保护造血干细胞免受低氧刺激和DNA损伤诱导的凋亡，是应激状态下造血干细胞生长存活所必需的分子[2]。2005年年年年FaliniB[3]等首先在等首先在等首先在等首先在《《《《新英格兰医学杂志新英格兰医学杂志新英格兰医学杂志新英格兰医学杂志》》》》上撰文提上撰文提上撰文提上撰文提出出出出成人成人成人成人AML患者可存在患者可存在患者可存在患者可存在NPM基因突变基因突变基因突变基因突变。。。。我们及时跟踪到这项重大发现，并在国内首发了第一篇相关综述｛核仁磷酸蛋白突变与血液肿瘤.中国实验血液学杂志，2007；15（3）：662－666｝，建立了NPM基因突变检测方法｛临床检验杂志，2008；26（1）:20-23｝。国家自然科学基金申请书2008版第6页版本1.003.844目前认为NPM是AML发生突变频率最高的基因，可出现在50％～60％染色体核型正常的AML患者和三分之一的成人AML患者，并分布在除M3、M4eo、M7以外的AML各FAB亚型中。自2005年以来陆续发现有四十余种NPM基因突变的变异体，大多是在外显子12的不同位置插入不同的核苷酸导致的，主要以六种变异体（mutationA-F）为主，其中最常见的是mutationA（约占70%），是在野生型NPM核苷酸序列上第956-959位上插入一个TCTG四核苷酸而形成串联重复序列，导致NPM蛋白C端的色氨酸发生突变，形成一个核输出信号序列，最终使NPM移位形成胞质NPM蛋白[4]。在伴有NPM突变AML患者的白血病细胞胞浆中能检测到大量突变型的NPM蛋白，因此被命名为胞浆型NPM蛋白阳性(cytoplasmicNMP，NPMc+)的AML。NPMc+AML患者往往染色体核型正常，不伴有AML的重现性基因异常，具有独特的临床特征和基因表达谱，这些生物学特性使NPMc+AML成为独立的白血病亚群成为独立的白血病亚群成为独立的白血病亚群成为独立的白血病亚群，因此FaliniB等[5]在2006年建议把建议把建议把建议把NPMNPMNPMNPM突变这一新突变这一新突变这一新突变这一新指标纳入指标纳入指标纳入指标纳入WHOWHOWHOWHO分型标准分型标准分型标准分型标准，以弥补当前WHO分型标准中不能细分核型正常AML群体的不足。NPM突变除了有助于白血病诊断分型外，还用于监测MRD。研究发现NPM基因突变仅发生在白血病细胞，并不累及正常血细