药物毒理学技术方法研究进展

DrugEvaluationResearch第35卷第4期2012年8月-241-•专论•药物毒理学技术方法研究进展杨佳梅1，刘妍2，申秀萍2，张宗鹏2*1.天津中医药大学，天津3001932.天津市新药安全评价研究中心，天津300301摘要：药物是否安全和有效是药物研发成功与否的决定性因素。就药物研发的整个流程而言，毒性是终止药物研发的重要原因之一。药物毒理学研究贯穿于新药发现阶段、临床前安全性评价和上市后跟踪监督的全过程，因此药物的毒理学研究至关重要。简要综述了药物毒理学研究过程中所涉及的技术方法以及研究新动向，并主要介绍了组学技术的发展。关键词：毒理学；替代实验；组学技术中图分类号：R965.3文献标志码：A文章编号：1674-6376(2012)04-0241-05ResearchprogressintechnicalmethodsondrugtoxicologyYANGJia-mei1,LIUYan2,SHENXiu-ping2,ZHANGZong-peng21.TianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine,Tianjin300193,China2.TianjinCenterforDrugSafetyEvaluationandResearch,Tianjin300193,ChinaAbstract:Ifthedrugissafeandeffectiveisthedecisivefactortodeterminewhetherthedrugdevelopmentissuccessfulornot.Asfarastheentiredrugdevelopmentprocessisconcerned,toxicityisoneimportantreasonfortheterminationofdrugdevelopmentprocess.Studiesondrugtoxicologyarethroughouttheentireprocessofdrugdiscoverystage,preclinicalsafetyevaluation,andafter-saletracksupervision,asaresultthedrugtoxicologystudiesiscritical.Thisarticlebrieflysummarizedthetechnology,methods,andnewresearchtrendsinvolvedindrugtoxicologystudies,andintroducedthedevelopmentofomicstechnology.Keywords:toxicology;replaceexperiment;omicstechnology药物毒理学研究贯穿于新药发现阶段、临床前安全性评价和上市后跟踪监督的全过程，因此药物的毒理学研究显得至关重要。本文简要综述了药物毒理学研究过程中所涉及的技术方法以及研究新动向，并主要介绍了组学技术的发展。1整体动物在药物毒理学研究中的应用1.1正常动物在毒理学领域，药物的安全性评价体系常用到正常动物，包括啮齿类动物（如大鼠、小鼠、豚鼠、仓鼠等）和非啮齿类动物（如家兔、比格犬、猴、小型猪等），这些正常动物主要用于进行急性毒性实验、长期毒性实验和特殊毒性实验等。通过不同的给药方式给予相应的受试药物一定时间后，采用特定方法测定各项生理生化指标用于评价受试药物对健康动物有无毒性，并以此确定试验动物对毒物的毒性反应、中毒剂量（poisoningdose）和致死剂量（lethaldose）等，为药物进入临床阶段提供参考依据并将结果外推至人类。经过毒理学工作者的不断努力，传统的急性毒性实验已经在减少动物的使用量上取得了很大的进步，主要表现为应用上下法、固定剂量法、探测剂量法、近似致死剂量法等新的方法替代传统的急性毒性实验，并已经很大程度上减少了实验动物的使用量。1.2基因动物对受试物进行器官毒性评价等研究时，经常使用各种模型动物。将诱发性模型动物、转基因动物、基因敲除动物应用到实验当中，进而研究各种模型下应用受试物后机体的异常反应，以寻找预测各类收稿日期：2012-04-17基金项目：“重大新药创制”科技重大专项“十二五”计划（2012ZX09505001-001）作者简介：杨佳梅（1985—），女，硕士生，主要从事药理学及毒理学研究。E-mail:[e-mail]*通讯作者张宗鹏，男，研究员。E-mail:[e-mail]h第35卷第4期2012年8月-242-疾病更加有效的手段。石艳等[1]用庆大霉素诱导急性肾损伤大鼠模型来测定肾损伤分子-1（kim-1）的表达，并明确了kim-1可作为庆大霉素所致肾小管损伤的早期诊断标志物。在毒理学研究领域中，重要的问题是如何把从整体动物获得的资料外推至人类，把体内外信息结合，把复杂的整体系统化为简单的可控系统，以及如何提高检测的敏感性等。建立转基因动物模型为解决这些问题提供了新手段。转基因动物模型主要分为一般毒性研究模型、致突变检测模型、致癌检测模型、生殖检测模型和毒物代谢研究模型。如C-fos-LacZ转基因小鼠可用于神经毒性的研究，Corchero等[2]成功制备了表达人类CYP2D6基因的转基因鼠模型，并用循环系统药物异喹胍进行验证，研究发现在该药的代谢过程中CYP2D6基因的表达受HNF4α调控，在无HNF4α时异喹胍4-羟化酶活性降低了50%，显示CYP2D6模型可以很好地应用于药理、毒理的临床前研究。近年来也有学者将绿色荧光蛋白转基因小鼠应用于毒理学中，这些转基因动物的应用不仅提高了实验动物的敏感性，也一定程度上满足了动物福利的要求，并且大大缩短了药物毒性评价时间。继转基因技术后，基因敲除动物技术掀起又一场分子生物学技术的革命。这是一种在基因组水平上改变或破坏靶基因结构，使其功能完全丧失的实验技术。该系统的建立，使得对基因靶位时间和空间上的操作更加明确、效果更加可靠，它的发展将为发育生物学、分子遗传学等学科提供一种全新的研究手段，具有广泛的应用前景。目前，基因敲除动物模型主要用于遗传性疾病的研究，现在也用于器官移植、免疫耐受、基因功能鉴定以及表型研究。Shimada等[3]首次建立了P53和E钙蛋白基因的小鼠弥散性胃癌模型，研究了以上两种基因对转移弥散性胃癌小鼠的协同抗癌活性。研究发现该模型可以很好地阐明遗传性胃癌的发病机制，并为预防和治疗弥散性胃癌提供了新的重要途径。整体动物在毒理学研究中应用广泛，不同的转基因动物模型和基因敲除动物模型的建立，将对阐明外源化学物毒性作用机制起到重大作用。但是该方法制作基因动物模型效率低，动物行为难以控制，且基因整合机制不清，存在一定局限性。2体外替代实验技术的发展使用正常动物的实验在毒理学研究的应用中存在着不敏感、周期长、所需受试物样品多、所需实验动物量大、难以揭示毒作用位点和毒作用机制以及结果可靠性差等问题。而模型动物也存在着制造价格昂贵、受世界动物保护法限制等不足之处。因此，在“3R”原则（替代、优化、减少，replacement、refinement、reduction）的指导下，一些发达国家率先开展了替代方法的研究。目前体外替代方法的研究已成为实用性毒理学领域研究的新方向。主要包括离体器官实验和体外细胞培养实验。这类方法的应用一方面解决了整体动物实验中大量使用实验动物且以动物濒死或死亡为终点的伦理问题，另一方面增加了实验过程中的可控因素，提升了实验结果的可靠性。2.1离体器官实验以体内脏器为基础的体外模型，一方面保留着完整的营养供给系统，能够确保在一定时间内保持离体器官的正常生理活性及生化功能，另一方面离体系统可排除其他组织器官的干扰，可控制受试物浓度，并可定量观察受试物对离体系统的毒性作用。目前，离体器官实验主要采用离体灌流技术，包括离体的肝脏、肾脏、心脏灌流技术等，用于研究外源化合物的靶器官毒性，如采用该技术研究抗病毒鸟苷酸类似物AM188以及其前体药AM365在肝脏的代谢情况；应用循环式离体大鼠肝脏灌流技术研究抗癌药物喜树碱和羟基喜树碱的代谢产物[4]。离体器官实验的缺陷在于受时间限制以及操作复杂，但是排除了体内其他脏器及系统的影响，因此在药物毒性评价中应用广泛。2.2体外细胞培养体外细胞培养使毒理学研究从简单的整体动物实验深入到复杂的细胞和分子水平，脱离了整体稳态和内分泌调控作用，从蛋白质、酶、受体、分子通道以及遗传因素等方面解析了药物与机体间的相互作用，在投药准确性和结果可靠性上显示了优越性。作为体外细胞实验金标准的原代肝细胞培养技术广泛应用在毒理学研究各领域，如通过测定培养肝细胞中转氨酶的活性，评价有机和无机化合物的肝细胞毒性[5]，通过体外培养原代人肾细胞评价霉菌素在人体外肾细胞的吸收、分布、代谢和毒性作用，都获得了很好的结果[6]。有学者在建立胚胎干细胞测试模型（EST）时发现EST能对大多数化学物的胚胎毒性进行正确分类，并且其结果与整体动物体内实验一致[7]。万旭英[7]尝试建立大鼠腔前卵泡体外培养体系，并用此体系初步验证了4种卵巢DrugEvaluationResearch第35卷第4期2012年8月-243-毒物的卵巢毒性，初步验证了邻苯二甲酸二乙基己酯（DEHP）雌性生殖毒性是通过其代谢产物邻苯二甲酸单乙基己酯（MEHP）作用的。与离体靶器官实验模型相比，细胞培养可延长靶器官的存活时间，给实验操作和毒性观察带来极大便利，并且单层培养的细胞可用于研究毒物对完整细胞功能的影响。当前，毒理学界对模式生物斑马鱼的关注度颇高。斑马鱼胚胎提供了复杂的多细胞系统，被称为培养细胞检测和整体动物实验间的桥梁，主要用于药物急性毒性研究[9]，成为近年来国内外学者研究的热点之一，尤其是国内一些学者将其应用于中药毒性研究当中。斑马鱼具有敏感性超强、被测药物使用量少以及具有整体器官模型的特点，非常适合多成分、多效应、多靶点的中药的毒作用研究。姜玮等[10]用斑马鱼初步观察甘遂不同提取物的急性毒性。通过将不同浓度的甘遂提取物添加到斑马鱼生活的水中，观察给药96h后鱼的死亡情况，发现甘遂先醇提后水提产物的急性毒性昀强，单纯水提物毒性昀弱，该结果为判断待测药物毒性的大小提供了依据，这些研究成果对建立中药毒性评价新方法新体系做出了重要贡献。3组学技术3.1“组学”的形成传统的体内体外实验主要以整体动物或应用体外培养低等生物、高等生物的组织、细胞、细胞器为模型，以细胞学、生理学、形态学和代谢等生物学指标为检测终点，对药物进行早期毒性筛选及机制研究。生物物种间生理代谢均存在差异，将以上实验结果外推至人类，预测药物对人体的毒性反应是否可靠，仍是值得深究的问题。为了弥补传统毒理机制研究方法的不足，近年来国内外毒理学工作者正致力于一系列的组学技术研究。目前把对细胞内DNA、RNA、蛋白质、代谢中间产物的整体分析手段称为组学技术，主要包括基因组学（genomics）、蛋白质组学（proteomics）和代谢组学等。Nount等[11]利用这些组学技术对候选新药进行毒理机制研究，从而开创了“反向毒理学”的药物毒性机制研究新模型。组学技术的发展实现了从器官、组织水平向分子甚至基因水平的飞跃。这使人们对基因和基因组的认识，对生命本质的认识和认识生命、健康的手段取得了重要的进展[12]。3.2基因组学基因组学利用基因组学的相关信息，将遗传学与生物信息学相结合，从基因整体水平研究外源化合物的毒性作用，建立毒性作用与基因表达变化之间的关系，从而有效监测接触外源化合物后基因水平的改变，继而筛选和鉴别潜在的遗传毒物，并快速确定未知毒物的作用机制。毒物基因组学（toxicogenomics）将基因组学方法与技术应用于毒理学研究领域，主要采用DNA微阵列技术研究毒物和毒作用机制，其快速发展为毒理学开辟了新的研究领域。基因组学技术有助于对毒物进行分类、检测，鉴定毒作用机制亚型