高效液相色谱法的应用综述

HPLC法的应用综述摘要：在手性药物研究中手性药物拆分的作用越来越重要，已成为国际上分析科学中的难点。HPLC法是通过将手性药物引入手性环境使对映异构体间呈现物理特征的差异而进行分离的，一般分为直接法和间接法，前者直接以手性流动相（chiralmobilephase，CMP）或手性固定相（chiralstationaryphase，CSP）进行分离；后者是对映体混合物用手性试剂作柱前衍生，形成一对非对映体，然后以常规固定相分离，该法亦称作手性衍生化试剂法（chiralderivatizationreagent，CDR）。本文综述了HPLC法在手性药物拆分中的应用。关键词：HPLC（高效液相色谱）；手性药物；对映异构体；色谱法是利用混合物中各组分在两相中分配系数不同，当流动相推动样品中的组分通过固定相时，在两相中进行连续反复多次分配，从而形成差速移动，达到分离的方法。根据流动相的状态可分为气相色谱法和液相色谱法。在液相色谱中，采用颗粒十分细的高效固定相并采用高压泵输送流动相，全部工作通过仪器来完成。这种色谱称为高效液相色谱(highperformanceliquidchromatography，HPLC)。气相色谱适合分析较易挥发、且化学性质稳定的有机化合物，而HPLC则适合于分析那些用气相色谱难以分析的物质，如挥发性差、极性强、具有生物活性、热稳定性差的物质。如今，HPLC因其独特的优点广泛应用于食品安全检测，药物含量测定、组成分析、质量控制等方面，成为分析化学中最重要的分析方法之一。1.HPLC在食品安全中的应用在食品检测中应用较广泛的是HPLC，近几年发展起来的高效液相色谱—质谱联用技术（HPLC-MS），集液相色谱对复杂基体化合物的高分离能力和质谱独特的选择性、灵敏度、相对分子质量及结构信息于一体而广泛应用于食品检测方面，为食品工业中原材料筛选、生产过程中质量控制、成品质量检测等提供了有效的分析检测手段[1]。（1）食品中残留农药的检测HPLC-MS日益广泛地应用于不同类型兽药、农药及毒素类有毒有害物质的检测分析,与其他液相色谱应用不同的是,食品及农产品的残留分析对灵敏度、重现性与选择性的要求非常高,常常需要在复杂的基质中检测ppb级甚至更低浓度水平的痕量残留物质。若想达到上述目标,不仅需要良好的样品前处理手段来净化复杂的食品及农产品本底,浓缩目标成分,而且需要选择高性能、高灵敏度的HPLC或HPLC-MS系统进行检测分析。韩红新、吴莉宇等[2]应用HPLC-MS同时分析蔬菜中氟铃脲、伏虫隆、虱满脲、氟虫脲4种农药残留。采用C18柱,大气压化学模式电离,多反应离子监测方式检测,方法对氟铃脲、伏虫隆、虱满脲、氟虫脲的检出限分别为0.02、0.02、0.02、0.02mg·kg-1,在0.05~0.5mg·kg-1范围内回收率为75.2%~84.5%,其研究结果达到农药残留分析要求,可以满足我国在食品质量安全检测技术方面的要求。(2)食品中有害添加剂、违禁物质的检测食品是人类生活中不可缺少的必需品，在食品生产过程中往往需要添加防腐剂、抗氧化剂、人工合成色素、甜味剂、保鲜剂等化学物质，它们的含量过高会对人体产生不同程度的危害，甚至威胁人的生命安全，所以有必要建立一套能够快速鉴定并且准确定量食品中有害添加剂和违禁药物的方法。而HPLC-MS只需对样品进行简单预处理，适用于含量少、不宜分离得到或在分离过程中容易发生变化或损失的成分[3]。因此HPLC-MS联用技术在对食品中违禁物质和有害添加剂的分析研究中得到广泛的应用。黄芳、黄晓兰等[4]建立了食品中三聚氰胺的高效液相色谱-质谱测定方法,用KromasilC18柱(4.6mm×250mm,5μm),流动相：乙腈-0.1%甲酸(体积比5:95),采用正离子模式的电喷雾质谱检测,线性范围为0.01~0.5mg·L-1,检出限0.01mg·L-1(S/N=3),回收率为80%~99%。周运柯、梅玉琴等[5]建立了同时测定酱油中的十种常见添加剂的高效液相色谱法，提高了检测效率。方法采用20%甲醇提取并沉淀，用C18色谱柱(150mm×4.6mm,5μm)，甲醇和0.02mol/L醋酸铵为流动相进行梯度洗脱，22min即可分离十种添加剂。添加剂回收率为94.8%~101.0%，相对标准偏差(RSD)为1.98%~4.14%(n=6)。该方法简便、快速、灵敏度高，适用于酱油中常见添加剂的快速测定。2.HPLC法在药物分析中的应用HPLC由于具有高选择性、高灵敏度，并可同时用于有关物质检查与含量测定的特点，已成为医药研究的有力工具。如在中草药有效成分的分离和纯度测定、人工合成药物成分的定性和定量测定、新型高效手性药物中手性对映体含量的测定以及药物代谢物的测定等方面，都需要用到HPLC的不同测定方法予以解决。（1）HPLC在中药分析中的应用中药历史悠久，源远流长。它不仅是我国医药体系中独具特色的重要组成部分，也是西方医药，特别是植物药、天然药物的有机组成部分。刘艳芳、刘艳明等[6]便用HPLC分离分析方法对中药物质基础进行了研究。本文针对液相色谱方法在中药物质基础分离分析中存在的问题与难点，结合红花、黄连、姜黄三味药材样品，从亲水色谱分离模式、新型色谱固定相、二维液相色谱分离系统和液相色谱质谱联用技术等方面讨论了液相色谱的分离分析方法和发展方向。结果表明，高效液相色谱新技术新方法在中药复杂体系的分离分析中具有很大的发展潜力和应用前景。康健、阚全程等对板蓝根药材中水溶性成分的高效液相特征图谱进行了研究。板蓝根抗病毒作用相关的成分主要集中在大极性部位，这与板蓝根临床应用以水提取物[7]为主相符。本实验采用了HPLC法，对于10批板蓝根药材的水提取物进行了指纹图谱研究[8]，为深入研究板蓝根的质量标准提供了实验基础。另外，邵林、郭庆梅等[9]对山东不同栽培品种金银花HPLC的指纹图谱进行了比较研究，建立了山东不同栽培品种金银花的HPLC对照指纹图谱，可为金银花的质量考察、品种鉴定及划分提供一定的参考依据。但由于中药化学成分的复杂性，中药成分分析一直存在着分离难度大、分析时间长等问题。近年来，快速高效液相色谱分离技术的发展与成熟有效地弥补了传统高效液相色谱（HPLC）分析中存在的不足，使中药化学成分分析进入了高效、高通量的阶段[10]。（2）HPLC在复方成药分析中的应用芪参益气滴丸是提取丹参、黄芪、三七、降香药材中的有效成分精制而成的滴丸制剂[11,12]，具有益气通脉、活血止痛的功效，现已广泛用于临床心血管疾病的治疗。王静、魏娜等[13]进行了HPLC、UPLC测定芪参益气滴丸中5个丹参活性成分含量的比较研究。本研究分别采用HPLC和UPLC技术，建立了同时测定丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B和丹酚酸A共5个主要成分含量的方法，为控制芪参益气滴丸中丹参药材质量提供参考，并对两种方法进行了比较，UPLC方法的建立为高效、快速控制药品质量提供依据。实验结果：UPLC的分析时间少于HPLC；且5个物质在一定范围内均呈现良好线性，r均大于0.9998；两种方法的精确度、重复性、加样回收率和样品测定结果无显著性差异。结论便是HPLC和UPLC两种方法准确性、重复性均较好；UPLC分析比HPLC具有更加快速、高效的优势。铂类配合物作为一类无机抗癌药物，涉及的主要化学分析手段有炽灼残渣法、高效液相色谱法(HPLC)、薄层层析法、紫外分光光度法及毛细管电泳法等。其中，高效液相色谱法因分析速度快、分离效率高、检测灵敏度高、检测自动化、适用范围广等优点，已成为近年来铂类抗癌配合物化学分析最常用的手段[14]。（3）HPLC在手性药物分析中的应用在生物体内，几乎所有具有重要生理意义的有机生物分子都有手性，绝大多数都是旋光性物质。两种化学组成、分子式完全相同的化合物，但因组成化合物的原子在空间取向不同，而成为镜像的化合物，称为手性化合物。由于对映体的物理、化学性质相同，实现它们的分离就比较困难，如大多数氨基酸都有右旋体和左旋体，但往往只能获得右旋体和左旋体的混合物。手性药物往往呈现一种对映体具有强的生物活性和药效，而另一种却无效。近年来，对手性药物的拆分定量分析进行了广泛深入的研究。其中，对生物体液中药物对映体的分离分析，有利于了解各种对映体的药代动力学、体内代谢过程和生物利用度。因此对手性药物对映体的拆分也是HPLC分析的热点。手性HPLC拆分法是以现代HPLC技术为基础引入手性环境使对映异构体间呈现物理特征的差异而进行分离。目前，HPLC是在手性药物拆分中应用最多的方法之一，可以预见，该方法因其具有快速、方便、精确的特点，在未来的手性药物研究中，将得到更广泛的应用。姚军、何晓文等利用高效液相色谱-质谱法测定棉籽仁中左旋和右旋棉酚的含量。近年来的研究表明，(-)-棉酚表现出更强的毒副作用[15]，其中抗生精作用是(+)-棉酚的十倍，而(+)-棉酚几乎无活性。本文在已有文献的基础上，建立一种高效液相-质谱法测定棉籽仁中(-)-棉酚和(+)-棉酚含量的检测方法，该方法专属性强、灵敏度高，样品处理简便易行，适于食品和饲料中(-)和(+)-棉酚的含量测定，为正确评估棉酚的毒性提供一定参考价值。（4）HPLC在临床生物样品分析及药代动力学研究中的应用HPLC能同时进行分离和定量测定的优点在治疗药物检测和药物代谢动力学中体现地尤为突出[16]。为了达到药品应用的安全、有效、可靠，这就需要了解和研究药物及其制剂在体内的过程（吸收、分布、代谢、排泄），以便研究药物的作用机制及药效学。同时随着药物分析技术的不断进步和发展，可对人体和动物体内（体液、组织和血中）药物及其代谢物的浓度进行定量分析，它对药品的评价、指导临床合理用药和药代动力学研究均具有重要的意义和现实需要。杜青青、王凌等利用高效液相色谱-串联质谱法测定人血浆中哌罗匹隆浓度及药动学。盐酸哌罗匹隆（PerospironeHydrochloride）属于非典型抗精神活动药物，主要通过抑制5-HT2A和多巴胺D2受体发挥作用。与典型抗精神活动剂不同，本品对精神分裂患者的阳性和阴性以及一般症状均有较好缓解作用，且锥体外系反应不明显。临床上主要用于精神分裂症治疗[17]。该药于2001年由日本住友公司开发成功，并在日本上市，我国于2008年上市。相关血药浓度测定方法及药动学研究，一般采用HPLC、HPLC-MS等方法[18]。本文采用HPLC-MS/MS法测定血浆中哌罗匹隆浓度，方法稳定可靠，并用于盐酸哌罗匹隆片的药动学研究。3.HPLC在杂志检查中的应用HPLC分离效能高，灵敏，在药物的杂质检查中应用广泛，主要用于药物中有关物质的检查。若杂质是已知的，又有杂质的对照品，可用杂质对照品做对照进行检查；若杂质是未知的，可以采用主成分自身对照法或峰面积归一化法进行检查[19]。4.HPLC在毒物分析中的应用毒物分析工作的任务是准确的定性定量分析复杂体系（生物样品）中毒物的原形及其代谢产物（或降解产物）。由于毒物的含量一般都极低，同时又都是未知物，因此，必须选择可靠灵敏的分析方法，用于毒物分析，HPLC完全符合要求。（1）HPLC在生物毒素分析中的应用一些食品在加工过程中会产生化学变化，生成对人体有害的物质。柳其芳等[20]对食品中致癌物丙烯酰胺进行了固相萃取-二极管阵列检测-反相高效液相色谱法测定，同时用此方法分析了59份面包、谷类、豆类、坚果类和土豆类食品。结果显示，食品炸焦的程度越深，则丙烯酰胺含量越高。（2）HPLC在冰毒检测中的应用冰毒(甲基苯丙胺，MA)的主要活性代谢物苯丙胺(PA)与MA具有相似的药理作用，二者均为滥用药物“摇头丸”常见成分。杨小红等用HPLC-DVD法同时测定了临床中毒患者血浆中的MA和PA含量，为临床快速诊断和抢救提供了依据。鉴于近年来在我国沿海地区，私制冰毒事件时有发生，因此，该法也为打击走私冰毒提供了有力的手段。5.结语本文论述了HPLC及其联用技术在食品安全检测、常规药物分析、杂志检查及毒物分析等方面的新进展。随着HPLC联用技术的应