第六章-人工染色体

第六章人工染色体生物体的许多重要性状牵涉到复杂的生理生化反应系列，受多基因或基因簇的控制，与成百至上万千碱基的DNA片段相关。复杂基因组的物理作图和基因的定位克隆也涉及到大片段DNA的研究。因此，提高载体的容纳量一直是克隆载体的重要发展方向之一。随着脉冲电泳技术的发展以及基因组研究的日益深入，对可插入大片段DNA的克隆载体——人工染色体的研究取得了迅速的发展所谓人工染色体——是一类能在生物细胞中独立“稳定存在和遗传的人工重组DNA分子”。酵母人工染色体载体（yeastartificialchromosome,YAC，1000kb）细菌人工染色体（bacterialartificialchromosome,BAC，300kb）哺乳类人工染色体（MAC）P1衍生人工染色体现正在研究的人工染色体总结一、YAC的基本序列元件酵母染色体DNA自主复制顺序（ARS）酵母染色体的着丝粒顺序（CEN）酵母染色体的端粒顺序（TEL）第一节YAC——酵母人工染色体YAC载体主要是用来构建大片段DNA文库，特别用来构建高等真核生物的基因组文库，并不用作常规的基因克隆。正常酵母人工染色体含有：*四膜虫端粒（tel）定位于染色体末端一段序列，用于保护线状的DNA不被胞内的核酸酶降解，形成稳定的结构酵母自主复制序列（ARS)一段特殊的序列，含有酵母菌中DNA进行双向复制所必需的信号。酵母着丝点(CEN)有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点，使染色体在分裂过程中能正确分配到子细胞中。在YAC中起到保证一个细胞内只有一个人工染色体的作用。pYAC4：酵母第四条染色体的着丝粒。YAC载体的选择标记主要采用营养缺陷型基因TRP1：色氨酸生物合成基因缺陷型URA3：尿嘧啶生物合成基因缺陷型LEU2：亮氨酸合成基因缺陷型SUP4：赭石突变抑制基因作用方式：YAC载体配套工作的宿主酵母菌（如AB1380）的胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突变ade2-1。带有这个突变的酵母菌在基本培养基上形成红色菌落，当带有赭石突变抑制基因sup4的载体存在于细胞中时，可抑制ade2-1基因的突变效应，形成正常的白色菌落。由于酵母的染色体是线状的，因此其在工作状态也是线状的。但是，为了方便制备YAC载体，YAC载体以环状的方式存在，并增加了普通大肠杆菌质粒载体的复制元件和选择标记，以便保存和增殖。二、克隆策略YAC克隆DNA片段的过程是：目的基因在限制性内切酶酶解后变成大片段DNA，克隆进酵母载体DNA，转染酵母缩主细胞，扩增后，根据标记性状筛选出重组的人工染色体三、YAC克隆系统的特点1、YAC作为可提供大片段DNA的方法，简化了构建染色体延伸区域图谱和分离完整基因的过程（200～500kb，甚至1000kb）2、用酵母为宿主重新构建大的人类基因区段，可将小的重叠的YAC变成一个大的YAC3、酵母作为一种真核生物，为其它真核的DNA提供了更合适的环境四、YAC克隆系统的缺点首先，在YAC载体的插入片段会出现缺失（deletion）和基因重排（rearrangement）的现象。其次，容易形成嵌合体。嵌合就是在单个YAC中的插入片段由2个或多个的独立基因组片段连接组成。嵌合克隆约占总克隆的5%～50%。YAC染色体与宿主细胞的染色体大小相近，影响了YAC载体的广泛应用。YAC染色体一旦进入酿酒酵母细胞，由于其大小与内源的染色体的大小相近，就很难从中分离出来，不利于进一步分析。返回第二节细菌人工染色体（BAC）一、BAC特点1、是以大肠杆菌的F因子的重要位点及基因为主体的高通量低拷贝的质粒载体。2、F因子的特点又称致育因子，是一个100kb的质粒，能整合到宿主染色体中。并能高频率的转移遗传标记。F因子在大肠杆菌中的复制受到严格控制而保持低拷贝，一般为每细胞1～2个拷贝，其parB基因能够排斥细胞中的外源性F质粒，限制了细胞内质粒分子间的重排，降低了BAC中外源基因的重组和嵌合度带有外源片段的BAC载体在细菌细胞（重组缺陷型，rec－）中通常仅单个拷贝，这一特点有利于保持DNA大分子在细胞内稳定复制而不发生重组，尤其是重复序列多的DNA大分子克隆350kb•F因子具有携带1Mb插入片段的潜能，这就使构建具有大容量克隆能力的载体成为可能•将F因子经基因工程改良构成的BAC载体，可用于克隆100kb以上的DNA片段。二、BAC载体的结构1992年Shizuya利用F因子的复制起点和氯霉素抗性标记基因，在F质粒（pMBO131）基础上构建了第一代BAC人工染色体。能够克隆和保持大于100kb的DNA。•新一代BAC载体为7.4kb的环状质粒：•F因子的parA，parB，parC基因以保证低拷贝的BAC质粒在大肠杆菌分裂时均匀分配到子代细胞•oriS基因：来源于大肠杆菌F因子（致育因子）的严谨型控制的复制子解旋酶基因－repE：一个易于DNA复制的由ATP驱动的解旋酶选择标志基因Cmr－氯霉素抗性基因cosN—来源于λphage的cos位点，可以用λ末端酶切割BAC使之线性化NotⅠ识别序列，位点十分稀少。重组子通过NotⅠ消化后，可以得到完整的插入片段。lacZ基因－颜色鉴别重组子，外源基因插入Cre/loxP：来自P1噬菌体，Cre重组酶基因和loxP序列位于P1噬菌体基因组内，loxP是Cre酶的识别序列用相应的酶作不完全酶切，可以获得长度不等的DNA片段人工合成的进行末端标记的含有loxP序列的片段Cre酶识别loxP位点后形成的线性化的BACDNA经PFGE电泳后进行放射自显影，含有标记的loxP序列的片段会有条带利用Cre/loxP直接构建外源基因的限制酶谱三、BAC优点BAC载体的容载能力一般为100～350kb以大肠杆菌为寄主，转化率高，构建BAC文库比YAC文库更容易BAC载体以环型超螺旋状态存在，BAC载体空载时大小约7.5kb，在大肠杆菌中以质粒的形式复制，具有一个氯霉素抗性基因。外源基因组DNA片段可以通过酶切、连接克隆到BAC载体多克隆位点上，通过电穿孔的方法将连接产物导入大肠杆菌重组缺陷型菌株。装载外源DNA后的重组质粒通过氯霉素抗性和LacZ基因的α–互补筛选。BAC的复制子来源于F因子，可稳定遗传，嵌合及重组现象少可以通过菌落原位杂交来筛选目的基因，方便快捷BAC载体在克隆位点的两侧具有T7和SP6聚合酶启动子，可以用于转录获得RNA探针或直接用于插入片段的末端测序返回P1噬菌体与λ噬菌体一样，外有蛋白质壳。内含相当大的（110～115kb）线性DNA，并在体外包装于P1壳内。P1进入宿主细胞后环化，扩增。1994年，有人将P1和F因子克隆结合产生P1人工染色体克隆系统-----PAC。第三节其他的人工染色体一、P1人工染色体克隆系统-----PAC•基于PAC的人类基因组文库插入片段的大小在60kb～150kb之间。二、人类人工染色体返回1、自上而下的策略：是以天然染色体的断裂片段为基础，构建新的HAC这些断裂片段主要通过以下方法得到(ａ)低剂量辐射(ｂ)端粒定位染色体截断技术(ｃ)外源性ＤＮＡ片段定点插入后扩增(ｄ)天然染色体有丝分裂过程中自发形成将外源性端粒ＤＮＡ整合入哺乳动物染色体,可将该染色体截断,同时在断端产生新的端粒。研究者们应用这种技术修剪哺乳动物染色体，成功构建了一系列大小在0.5～6Ｍｂ之间不等ＨＡＣ。最初，端粒ＤＮＡ整合的位点是随机的，而现在，研究者们能够将端粒ＤＮＡ定点插入染色体中特定的位点。（2）自下而上的策略•该策略是在细胞内或者细胞外将着丝粒ＤＮＡ、端粒ＤＮＡ以及复制起点装配在一起，从而构建HAC。研究者应用这种策略，在ＨＴ1080细胞中得到了第一种ＨＡＣ。他们将1Ｍｂ的人17号染色体的α卫星ＤＮＡ、人端粒ＤＮＡ、人基因组ＤＮＡ随机片段用脂质体共转染ＨＴ1080细胞。经过重组，那些同时含有着丝粒、端粒、复制起点且按照正常染色体结构顺序的重组连接产物以染色体的形式稳定保存下来，而那些不完整或未按照正常顺序连接的产物因其不能稳定地进行有丝分裂而丢失、降解。由此通过有丝分裂而自然筛选出ＨＡＣ。质粒受体细胞结构插入片断举例E.coli环状〈8kbpUC18/19,T-载体pGEM-3z等λ噬菌体E.coli线状9-24kbEMBL系列，λgt系列丝状噬菌体及噬菌粒E.coli环状〈10kbM13mp系列粘粒载体E.coli环状35-45kbpJB8,c2RB,pcoslEMBL,pWE15/16,pCVBAC(BacterialArtificialChromosome)E.coli环状≈300kbPeloBAC系列PAC(P1-derivedArtificialchromosome)E.coli环状100-2000kbPCYPAC1YAC(YeastArtificialchromosome)酵母细胞线性染色体100-1000kbMAC(MammalianArtificialChromosome)哺乳类细胞线性染色体〉1000kb病毒载体动物细胞环状SV40载体，昆虫杆状病毒载体穿梭载体动物细胞和细菌环状pSVK3质粒，PBV,Ti质粒载体的种类和特征练习题已知基因a的表达产物是一种酶A，已知这种酶A具有几个保守位点，请考虑如何从基因组中扩增基因a，并实现体外高效表达？需要使用的质粒载体有哪些？酶切位点如何选择？保守区2保守区1保守区3酶A