专题5--DNA和蛋白质技术

专题五DNA和蛋白质技术课题1DNA的粗提取与鉴定课题2多聚酶链式反应扩增DNA片断课题3血红蛋白的提取和分离课题1DNA的粗提取与鉴定一、提取DNA的方法1、提取生物大分子的基本思路（1）选用一定的________或________方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。（2）DNA的粗提取就是利用DNA与______、______和________等在物理或化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。物理化学RNA蛋白质脂质（1）利用DNA的溶解性DNA的溶解度2、提取DNA分子的基本原理DNA不_______酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则_______酒精。利用这一原理，可将DNA与蛋白质进一步分离。溶于溶于①蛋白酶能水解蛋白质，但对________没有影响。②大多数蛋白质不能忍受____________的高温，而DNA在80℃以上才会变性。③洗涤剂能够瓦解__________，但对________没有影响。温度洗涤剂DNA60-80℃细胞膜DNA（2）利用DNA和蛋白质对酶、_______和________的耐受性不同（3）DNA的鉴定：DNA在沸水浴的条件下，遇________反应会呈现________二苯胺蓝色二、DNA的粗提取与鉴定的实验设计（一）实验材料的选取材料：新鲜的鸡血注意：本实验中，要往鸡血中加入抗凝剂（柠檬酸钠溶液）原则上只要含DNA的生物材料都可以，但是选取DNA含量相对较高的生物组织，成功率更大。(1)先将新鲜的鸡血离心，获得鸡血细胞(2)在鸡血细胞中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液1、破碎细胞讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？利用了什么原理？2、过滤，获取含DNA的滤液（三）去除滤液中的杂质讨论：为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离方案二利用了酶的专一性；方案三利用了DNA的稳定性。（四）DNA的析出与鉴定DNA的析出用的是与滤液体积相等的冷却的酒精溶液（体积分数为95％），静置2-3min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水1、DNA的析出A:2mol/L的NaCl溶液5ml+DNA丝状物+二苯胺试剂4mlB:2mol/L的NaCl溶液5ml+二苯胺试剂4ml混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min,待试管冷却后，比较两只试管中溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否有蓝色2、DNA的鉴定以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取②鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长1、鸡血细胞做实验材料的原因①鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得2、实验原理①DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度的变化而改变的。当NaCl的物质的量浓度为0.14mol／L时,DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。②DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。③DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。实验材料和用具实验材料：1、鸡血细胞液（5~10ml）；2、体积分数为95%的冷酒精溶液（实验前置于冰箱内冷却24h）；3、蒸馏水；4、质量浓度为0.1g/ml的柠檬酸钠溶液（抗凝剂）5、物质的量浓度分别为2mol/L和0．015mol/L的NaCl溶液；6、二苯胺试剂答：因为DNA不溶于冷酒精，而其他物质可以溶解在酒精中，使含杂质较少的DNA丝状物可以析出,悬浮于溶液中讨论：（2）观察丝状物呈什么颜色？答：白色（1）为什么要加50mL的冷酒精？答：有丝状物的试管变成蓝色，另一试管还是原来颜色（4）这一鉴定结果说明什么问题？（3）比较两个试管中溶液的颜色有什么不同？答：提取出的丝状物是DNA（5）DNA的直径约为20×10-10m，实验中出现的丝状物的粗细是否表示1个DNA分子直径的大小？答：DNA分子直径只有2nm。丝状物是多个DNA子聚在一起形成的答：整个实验共“两次蒸馏水，三次过滤，六次搅拌”总结：①两次蒸馏水第一次：使鸡血细胞吸水胀破，提取核DNA第二次：稀释NaCl溶液，使DNA黏稠物析出（1）此实验过程中有几次使用蒸馏水？几次过滤，几次搅拌？②三次过滤第一次：过滤核外物质，除去不溶的杂质第二次：过滤除DNA的其他核内物质，尤其是蛋白质第三次：过滤含DNA的NaCl溶液，得到滤液六次搅拌：搅拌目的第一次搅拌加蒸馏水的鸡血细胞液，加速细胞破裂第二次搅拌含DNA的高浓度盐溶液，加速_______________________第三次搅拌加蒸馏水的NaCl溶液，____________________________第四次搅拌含DNA的高浓度盐溶液，加速_______________________第五次搅拌含DNA的酒精溶液，提取__________________________第六次搅拌含DNA白色丝状物的盐溶液，加速__________________DNA的溶解均匀稀释以析出更多DNADNA的溶解含杂质较少的DNADNA的溶解观察你提取的DNA颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多；二苯胺鉴定出现蓝色说明实验基本成功，如果不呈现蓝色，可能所提取的DNA含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新制备四、课题成果评价（一）是否提取出了DNA本实验提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质（二）分析DNA中的杂质课题2多聚酶链式反应扩增DNA片断DNA分子的结构C、H、O、N、P1.元素组成：脱氧核苷酸2.基本单位:3.DNA分子的双螺旋结构（1）DNA分子是由的（脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则结构。（2）与交替连结，排列在外侧，构成基本骨架；排列在链的内侧。（3）两条链上的碱基通过连结起来，形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即腺嘌呤一定与配对，一定同胞嘧啶配对。双螺旋两条反向平行脱氧核糖磷酸碱基氢键胸腺嘧啶鸟嘌呤4.DNA的复制b.时期有丝分裂间期减数第一次分裂前的间期。c.场所细胞核（主要）、线粒体、叶绿体。a.概念由一个DNA形成两个完全相同的DNA的过程。d.基本条件酶:解旋酶、DNA聚合酶能量:ATP原料:四种脱氧核苷酸模板:DNA的两条链参与的组分在DNA复制中的作用解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物总结：胞内DNA复制的基本体系打开DNA双链提供DNA复制的模板合成子链的原料催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸一、PCR技术是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。（1）3′端和5′端：为了明确地表示DNA的方向，通常将DNA的羟基（—OH）末端称为________，而含____________的末端称为________；一个双链DNA分子中含两个3′端和两个5′端，如果一条链的方向是________，则另一条链的方向就是________，这就是反向平行的含义。3’端5’端磷酸基团5’→3’3’→5’1、PCR扩增方向（2）DNA分子中相邻两个脱氧核苷酸残基通过________________相连，该化学键是由一分子脱氧核苷酸中3号碳原子上的羟基（—OH），与相邻的另一分子脱氧核苷酸中5号碳原子上的磷酸基团脱水聚合而成。所以DNA的合成方向总是从子链的________向________延伸。3’5’磷酸二酯键5’端3’端2、PCR技术原理（1）PCR：DNA分子在一定条件下可以进行________复制。（2）DNA的热变性原理：在________的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为________；当温度缓慢下降后，两条被分离的DNA链又会重新结合成双链，这个过程称为________。体外80-100℃变性复性二、PCR的反应过程DNA模板与模板DNA两条链相结合的两种引物1、反应条件稳定的缓冲液环境四种脱氧核苷酸耐热的DNA聚合酶严格控制温度变化的控温设备靶序列靶序列第一步：变性（90-95℃）2、反应过程第二步：复性（50℃左右）第三步：延伸（72℃左右）第1个PCR循环完成后：得到两个DNA分子3、结果（P60页图5-9复制结果）（1）PCR的每一轮循环包括变性、复性和延伸三步，从第二轮循环开始，每次循环的产物也做模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸。这样，DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的DNA序列呈____________。指数扩增（2）PCR一般要经历三十多次循环，处于两引物间固定长度的序列数目约为________。2301、PCR仪（一）.设备及用具实质上一台能够自动调控温度的仪器。三、PCR的实验操作2、微量离心管一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml3、微量移液器用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次。1.准备2.移液（二）实验操作步骤按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上。用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂。混合后盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。3.混合（1）过程：将微量离心管放在离心机上,离心约10s。4.离心（2）离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果。将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序。5.反应循环数变性复性延伸第一次94℃，5min－－30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次94℃，1min55℃，30s72℃，1minPCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤──变性、复性和延伸.PCR技术高度灵敏，为了避免外源DNA等因素的污染而造成干扰实验，PCR操作时要注意做到：6.注意事项（1）隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；（2）分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头（一）、理论上DNA扩增数目的计算三、课题成果评价1.一条DNA，复制n次，DNA为2n2.a条DNA，复制n次，DNA为a×2n（二）、实验中DNA含量的测定1.原理可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关。2.过程（1）稀释2uLPCR反应液，加入98uL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释.以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零。取DNA稀释液100uL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值DNA含量(g)＝50×(260nm的读数)×稀释倍数50：在标准厚度为1cm比色杯中，OD260为1相当于50g/mL的双链DNA分子（2）对照调零（3）计算（4）计算光吸收波长／nm2602402202800.10.2比色杯课题3血红蛋白的提取和分离一、分离蛋白质的基本方法原理1、凝胶色谱法（分配色谱法）：a.凝胶：一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖，具多孔的凝胶就叫分子筛）b.概念：根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用来进行分离。相对分子质量直径大小运动方式运动速度运动路程洗脱次序大____凝胶颗粒空隙直径，被排阻在____垂直向下移动____较短先从凝胶柱洗脱出来小____凝胶颗粒空隙直径，可以进入颗粒内部垂