选修3-1-1DNA重组技术的基本工具

基因工程第一节：DNA重组技术的基本工具浚县一中刘秀荣据WTO调查：2004年全世界因狂犬病致死人数约5.5万人中国卫生部通报：2004年７月，狂犬病列法定报告传染病死亡数之首。发病死亡率近100%.能产生狂犬病抗体蛋白的转基因植物基因工程的概念基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人类需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫DNA重组技术。基因工程的别名DNA重组技术操作环境生物体外操作对象基因操作水平DNA分子水平基本过程剪切→拼接→导入→表达结果人类需要的基因产物或性状概念分析：问题探讨：苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。想一想需要做哪些关键工作？苏云金芽孢杆菌毒蛋白普通棉花抗虫棉普通棉花(无抗虫特性)苏云金芽孢杆菌提取抗虫基因棉花细胞(含抗虫基因)棉花植株(有抗虫特性)上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？重组DNA导入形成基因工程培育抗虫棉的简要过程基因工程培育抗虫棉的关键步骤关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来关键步骤二：形成重组DNA关键步骤三：重组DNA导入受体(棉花)细胞1.1DNA重组技术的基本工具关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来关键步骤二：形成重组DNA关键步骤三：重组DNA导入受体(棉花)细胞“分子手术刀”——限制性核酸内切酶“分子缝合针”——DNA连接酶“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体“分子手术刀”——限制性核酸内切酶⒈主要来源：2.种类与命名：3.作用：4.作用结果：主要是从原核生物中分离纯化出来的一类酶。约4000种识别特定的核苷酸序列，断裂磷酸二酯键。形成粘性末端或平末端寻根问底•你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是是什么吗？原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。goback现在已经从约300种微生物中分离出约4000种限制性内切酶(限制酶)。EcoRⅠSmaⅠ粘质沙雷氏杆菌（Serratiamarcesens）大肠杆菌（EscherichiacoliR）练习：流感嗜血杆菌的d菌株(Haemophilusinfluenzaed)中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ•限制酶的识别序列：能被限制性内切酶特异性识别的切割部位都具有回文序列：在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。限制性核酸内切酶作用的是DNA分子中的什么键？磷酸二酯键即脱氧核糖、磷酸之间的连接ATGGCATCTTCGAAGPAPAGGobackEcoRⅠ黏性末端黏性末端•什么叫黏性末端？被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。SmaⅠ平末端平末端限制酶DNA解旋酶区别限制酶与DNA解旋酶的区别切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键将DNA两条链的氢键打开形成两条单链限制酶DNA水解酶区别限制酶与DNA水解酶的区别切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键，形成片段的DNA.（双链）切割磷酸二酯键，形成单个的脱氧核苷酸。目的基因所在DNA片段载体DNA片段EcoRⅠEcoRⅠDNA连接酶1.作用:把切下来的DNA片段拼接成新的DNA.2.作用原理：催化磷酸二酯键形成3.种类：⑴E·coliDNA连接酶⑵T4DNA连接酶“分子缝合针”——DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，E·coliDNA连接酶或T4DNA连接酶即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？T4DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低DNA连接酶DNA聚合酶连接DNA链连接部位相同点双链单链在两DNA片段之间形成磷酸二酯键将单个核苷酸加到已存在的核酸片段的3’末端的羟基上，形成磷酸二酯键都能形成磷酸二酯键二者都是蛋白质类化合物尝试写出下列序列受EcoRI限制酶作用后的黏性末端CTTCATGAATTCCCTAAGAAGTACTTAAGGGATT“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体1.作用：2.条件：3.种类：质粒、λ噬菌体的衍生物和动植物病毒等。将外源基因送入受体细胞。⑴有1~多个限制酶切点⑵对受体细胞无害⑶使导入基因能在受体细胞中复制、表达⑷有某些标记基因，便于筛选⑶假如目的基因导入受体细胞后不能复制或不能转录，转基因生物能有预想的效果吗？⑴作为分子运输车——载体，如果没有切割位点将会怎样？⑵霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分子运输车吗？⑷目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？作为载体的必要条件:Goback质粒的特点：1.是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA分子外并能自我复制的小型双链环状DNA分子。能复制并带着插入的目的基因一起复制有切割位点有标记基因的存在，将来可用含青霉素的培养基鉴别。基因工程的工具限制酶主要存在于原核生物中具有专一性(识别序列)切开DNA分子的磷酸二酯键DNA连接酶连接磷酸二酯键种类E.coliDNA连接酶T4DNA连接酶载体具备的条件质粒、λ噬菌体衍生物、动植物病毒种类能自我复制有一个或多个酶切割位点有标记基因对受体细胞无害思考与探究P72、为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列；或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。3、天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？提示：基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒（plasmid），即独立于细菌拟核染色体DNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNA分子。是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？不是，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：思考与探究P71）载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。2）载体DNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。3）载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。4）载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。5）载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。4、DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA的酶。思考与探究P71)不属于质粒被选为基因运载体的理由是A、能复制（）B、有多个限制酶切点C、具有标记基因D、它是环状DNAD练习2）有关基因工程的叙述中，正确的是（）A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列B、质粒是基因工程中唯一的载体C、载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与目的基因连接D、DNA连接酶使黏性末端的碱基之间形成氢键C练习3）同一种限制酶切割成的黏性末端是A.①②B.①③C.①④D.②③A（10江苏卷）4.下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图l、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：•（1）一个图1所示的质粒分子经SmaⅠ切割前后，分别含有▲个游离的磷酸基团。•（2）若对图中质粒进行改造，插入的SmaⅠ酶切位点越多，质粒的热稳定性越▲。（1）0、2（2）高•（3）用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是▲。•（4）与只使用EcoRI相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止▲。（3）SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因、外源DNA中的目的基因（4）质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化•（5）为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入▲酶。•（6）重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了▲。（5）DNA连接（6）鉴别和筛选含有目的基因的细胞