重组人表皮生长因子对大鼠宫颈鳞状上皮细胞体外增殖的影响

重组人表皮生长因子对大鼠宫颈鳞状上皮细胞体外增殖的影响张琳，杨静，张晶，詹春（武汉大学医学院药理学系，湖北武汉４３００７１）摘要：目的研究重组人表皮生长因子（ｒｈＥＧＦ）是否促进大鼠宫颈鳞状上皮细胞（ＲＣＥＣ）增殖及有关机制。方法分离培养ＲＣＥＣ并用免疫组织化学技术鉴定细胞纯度；ＭＴＴ法检测细胞增殖；流式细胞术分析细胞周期；逆转录聚合酶链反应检测细胞周期蛋白Ｄ１（ｃｙｃｌｉｎＤ１）ｍＲＮＡ表达水平。结果ｒｈＥＧＦ刺激ＲＣＥＣ的增殖呈时间及剂量依赖性，且明显提高Ｓ期细胞分数。ｒｈＥＧＦ０．１，１．０，１０和１００μｇ·Ｌ－１明显提高ｃｙｃｌｉｎＤ１ｍＲＮＡ表达，以１０μｇ·Ｌ－１于ｄ３的作用最强，最高可达５０．７％。结论ｒｈＥＧＦ对ＲＣＥＣ有促进增殖的作用，其机制与增强ｃｙｃｌｉｎＤ１ｍＲＮＡ表达，以及刺激细胞从Ｇ０／Ｇ１期进入Ｓ期有关。关键词：表皮生长因子；宫颈疾病；鳞状上皮；细胞培养；细胞周期蛋白Ｄ１中图分类号：Ｒ９７９．１文献表识码：Ａ文章编号：１０００３００２（２００５）０３０２１４０６复层鳞状上皮与宫颈柱状上皮移行处是宫颈癌好发部位，而且该区域的复层鳞状上皮细胞的增殖和分化状态与宫颈糜烂和宫颈癌密切相关［１］，因此，研究宫颈鳞状上皮细胞增殖和分化的影响因素，有利于阐明宫颈糜烂和宫颈癌的发病机制。表皮生长因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ＥＧＦ）广泛存在于人体多种组织及体液中，与其受体（ＥＧＦＲ）结合可促进细胞的增殖和分化。研究表明ＥＧＦ在生殖系统如子宫、卵巢、胎盘中表达，近年来免疫组织化学技术证实ＥＧＦＲ也存在于人宫颈鳞状上皮［２］，提示ＥＧＦ收稿日期：２００４０７２１接受日期：２００５０１２８作者简介：张琳（１９７９－），女，药理学硕士研究生，主要从事药物作用的分子机制研究；杨静（１９６４－），女，博士，副教授，研究方向为分子药理。联系作者Ｅｍａｉｌ：[e-mail]：[phone]及ＥＧＦＲ可能对宫颈鳞状上皮的增殖和分化有重要的调节作用。本文研究重组人表皮生长因子（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ｒｈＥＧＦ）对大鼠宫颈鳞状上皮细胞（ｒａｔｃｅｒｖｉｃａｌｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ，ＲＣＥＣ）体外增殖的影响，为深入探讨宫颈糜烂和宫颈癌的发病机制提供实验依据。１材料与方法１．１试剂ｒｈＥＧＦ由武汉百科基因有限公司提供，纯度＞９８％，比活性＞１×１０９ＩＵ·ｇ－１；胰蛋白酶（ｔｒｙｐｓｉｎ），Ｄｉｆｃｏ产品；胶原酶Ⅰ型（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅｔｙｐｅⅠ），Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ产品；二乙胺四乙酸四钠盐（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｒｔｉｃａｃｉｄ，ＥＤＴＡ），Ａｍｒｅｓｃｏ产品；转铁蛋白（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）和霍乱毒素，Ｓｉｇｍａ产品；ＲＰＭＩ１６４０培养基、胎牛血清（ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ）和Ｔｒｉｚｏｌ试剂盒，Ｇｉｂｃｏ公司产品；小鼠抗大鼠细胞角蛋白多抗，ＳａｎｔａＣｒｕｚ产品；小鼠抗大鼠波形蛋白（ｖｉｍｅｎｔｉｎ）单抗，武汉博士德公司产品；小牛血清，杭州四季青公司产品、氢化可的松，扬州制药有限公司产品，胰岛素，中美合资沈阳济世制药有限公司产品。１．２动物ＳＤ大鼠，♀，体重４０～５０ｇ，由武汉大学实验动物中心提供。动物许可证号，ＳＹＸＫ（鄂）２００３０００４，ＳＰＦ级。１．３细胞分离和培养参照文献［３］稍加改良。处死大鼠，取宫颈部位的组织剪成１～２ｍｍ３的小块，用无菌Ｈａｎｋｓ平衡液（含１５ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＨＥＰＥＳ，青霉素１００ｋＵ·Ｌ－１，链霉素１００ｍｇ·Ｌ－１，两性霉素Ｂ０．２５ｍｇ·Ｌ－１，ｐＨ７．４）洗涤３次，０．１％胶原酶（１８９ｋＵ·Ｌ－１）在３７℃消化５０ｍｉｎ，然后用０．２％胰蛋白酶３７℃消化２０ｍｉｎ，Ｈａｎｋｓ平衡液洗涤２次，用生长培养基悬浮，将来自２个动物的宫颈组织接种于６０ｍｍ培养皿中，在３４℃，５％ＣＯ２培养箱中培养。生长培养基为Ａ和Ｂ·４１２·中国药理学与毒理学杂志ＣｈｉｎＪＰｈａｒｍａｃｏｌＴｏｘｉｃｏｌ２００５年６月；２００５Ｊｕｎ；１９（３）：２１４－２１９１９（３）：２１４－２１９（１∶１）两部分组成，Ａ和Ｂ成分如下。（Ａ）２４ｈ条件培养基：ＤＭＥＭ培养基（含１０％ＦＢＳ）培养Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３细胞２４ｈ后的培养基；（Ｂ）宫颈上皮细胞培养基（ｃｅｒｖｉｃａｌｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｍｅｄｉｕｍ，ＣＥＧＭ）：由ＨａｍＦ１２和ＲＰＭＩ１６４０（１∶１）组成，再添加７．５％猪血清、胰岛素（１０μｇ·Ｌ－１）、转铁蛋白（１０ｍｇ·Ｌ－１）、氢化可的松（６．５ｍｇ·Ｌ－１）、霍乱毒素（０．１ｎｍｏｌ·Ｌ－１）、牛脑提取物（１５０ｍｇ·Ｌ－１）。３ｄ后，弃去培养基，用ＤＨａｎｋｓ轻轻漂洗除去组织碎片。然后加入ＣＥＧＭ培养，当细胞达到融合后，先用ＤＨａｎｋｓ漂洗１ｈ，然后加入０．０２５％胰蛋白酶和０．５ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＥＤＴＡ（１∶１）消化，用ＣＥＧＭ重新悬浮，然后接种到预先铺有胶原凝胶（参照Ｅｌｓｄａｌｅ等［４］方法预先制备）的１００ｍｍ培养皿上。此二代培养物可以传代，先添加０．１％胶原酶０．００５Ｌ在３４℃孵育直到胶原完全液化（约１ｈ），用ＤＨａｎｋｓ洗涤细胞悬液，再用０．０２５％胰蛋白酶与０．５ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＥＤＴＡ（１∶１）在３７℃消化１０ｍｉｎ，细胞悬液经洗涤后重新悬浮在ＣＥＧＭ中，接种于预先铺有胶原凝胶的培养板，实验用第２～３代细胞。台盼蓝检测细胞活率大于９５％，细胞纯度鉴定采用免疫组化ＳＡＢＣ法，将生长有细胞的盖玻片从培养板中取出，丙酮固定，以小鼠抗大鼠细胞角蛋白多抗为一抗，二氨基联苯胺（ＤＡＢ）显色，胞浆被染成棕黄色者为阳性，实验同时设立阴性对照。显微镜下观察显色结果，细胞阳性率达９５％以上。１．４药物作用在上述培养基中分别加入不同浓度的ｒｈＥＧＦ为实验组，添加等容积的生理盐水为对照组，进行ＭＴＴ试验，观察浓度效应和时间效应；在上述实验结果的基础上，选择ｒｈＥＧＦ效应最大的时间收集各组细胞，进行流式细胞仪分析和ＲＴＰＣＲ测定。１．５ＭＴＴ比色法观察细胞增殖将细胞悬液调到１×１０９Ｌ－１，接种于９６孔培养板中，每孔１００μＬ，培养液不含小牛血清。分别加入ｒｈＥＧＦ１００μＬ，使终浓度为０．０１，０．１，１．０，１０和１００μｇ·Ｌ－１，另设阴性对照孔以生理盐水代替ｒｈＥＧＦ，每种处理设３个复孔，分别培养２４，４８，７２ｈ，在培养终止前４ｈ各孔加入５ｇ·Ｌ－１ＭＴＴ１０μＬ，继续培养４ｈ，去上清，每孔加入二甲基亚砜２００μＬ。将９６孔培养板在震荡器上震荡５ｍｉｎ，用酶标仪测定吸光度（Ａ５７０ｎｍ）值。选择促进ＲＣＥＣ体外增殖最强的ｒｈＥＧＦ浓度，分别培养１～５ｄ，用ＭＴＴ法测定细胞增殖。１．６流式细胞仪分析细胞浓度同ＭＴＴ，接种在３０ｍＬ培养瓶中，分别加入ｒｈＥＧＦ，终浓度、培养时间同ＭＴＴ法，培养液不含小牛血清。培养结束后，细胞用ＰＢＳ洗涤，７０％冷酒精固定过夜。５００目滤网过滤，碘化丙啶（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍｉｏｄｉｄｅ，ＰＩ，１００ｍｇ·Ｌ－１）染色３０ｍｉｎ。流式细胞仪分析细胞周期。用ＭｕｌｔｉＣｙｃｌｅｆｏｒＷｉｎｄｏｗｓ软件分析。１．７ＲＴＰＣＲ测定细胞周期蛋白Ｄ１ｍＲＮＡ表达水平细胞浓度同ＭＴＴ，接种在３０ｍＬ培养瓶中，分别加入ｒｈＥＧＦ，终浓度、培养时间同ＭＴＴ法，培养液不含小牛血清。培养结束后，细胞用ＰＢＳ洗涤，细胞总ＲＮＡ按Ｔｒｉｚｏｌ法制备，电泳分析表明５，１８及２８Ｓ条带清晰可见，总ＲＮＡ片段完整未降解。细胞周期蛋白Ｄ１（ｃｙｃｌｉｎＤ１）、内对照（β肌动蛋白，βａｃｔｉｎ）引物设计和ＲＴＰＣＲ反应建立参照文献［５］，稍加改动。ＲＴＰＣＲ产物经１．２５％琼脂糖凝胶电泳分离并与ＤＮＡ分子量标准（５０ｂｐＤＮＡ梯带，Ｇｉｂｃｏ）比较鉴定。用ＵＶＰ公司透射扫描仪进行电泳条带峰体积定量测定。以β肌动蛋白ＲＴＰＣＲ产物为内对照，计算ｃｙｃｌｉｎＤ１与β肌动蛋白基因扩增条带峰体积的比值，作为ｃｙｃｌｉｎＤ１ｍＲＮＡ表达的相对水平。选择具有最大促增殖效应的ｒｈＥＧＦ浓度，分别培养１～５ｄ。１．８统计学处理实验结果以珋ｘ±ｓ表示，采用ＳＰＳＳ１１．０统计软件进行方差分析。２结果２．１ｒｈＥＧＦ对大鼠宫颈上皮细胞增殖的影响ｒｈＥＧＦ（０．１～１００μｇ·Ｌ－１）浓度依赖性促进大鼠宫颈上皮细胞增殖，浓度为１０μｇ·Ｌ－１作用３ｄ达到最大促增殖效果（表１，２）。流式细胞仪分析结果显示，与对照组相比，ｒｈＥＧＦ０．１～１００μｇ·Ｌ－１作用３ｄ，Ｇ０／Ｇ１期细胞百分比明显减少，Ｓ期细胞分数明显增高，表明ｒｈＥＧＦ能刺激ＲＣＥＣ由Ｇ０／Ｇ１期进入Ｓ期，使分布在Ｓ期的细胞数增加（表３和图１）。２．２ｒｈＥＧＦ对细胞周期蛋白Ｄ１ｍＲＮＡ表达的影响ｒｈＥＧＦ０．１，１．０，１０和１００μｇ·Ｌ－１浓度依赖性增加ｃｙｃｌｉｎＤ１ｍＲＮＡ表达，与对照组相比差异具有统计学意义。ｒｈＥＧＦ１０μｇ·Ｌ－１作用１ｄ，ｃｙｃｌｉｎＤ１ｍＲＮＡ·５１２·中国药理学与毒理学杂志２００５年６月；１９（３）表达即增加，于ｄ２达高峰，结果见表４，表５和图２。Ｔａｂ１．Ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ（ｒｈＥＧＦ）ｏｆｖａｒｉｏｕｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎｒａｔｃｅｒｖｉｃａｌｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｒｈＥＧＦ／μｇ·Ｌ－１Ａ５７０ｎｍＡｃｃｅｌｅｒａｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔ／％Ｃｏｎｔｒｏｌ０．４１±０．０７－０．０１０．４６±０．０８１２．５０．１０．５５±０．０８３６．１１０．５８±０．１０４１．３１００．６４±０．１４５６．８１０００．６０±０．１１４８．４Ｒａｔｃｅｒｖｉｃａｌｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ（ＲＣＥＣ）ｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｒｈＥＧＦｉｎｃｅｒｖｉｃａｌｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｍｅｄｉｕｍ（ＣＥＧＭ）ｗｉｔｈｏｕｔｃａｌｆｓｅｒｕｍａｎｄｃｕｌｔｕｒｅｄｆｏｒ７２ｈ．Ｉｎｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，ｒｈＥＧＦｗａｓｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄｗｉｔｈｓａｌｉｎｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．珋ｘ±ｓ，ｎ＝６．Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１，ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ．Ｔａｂ２．Ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｏｆ１０μｇ·Ｌ－１ｒｈＥＧＦａｄｄｅｄｉｎｃｕｌｔｕｒｅｆｏｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｍｅｏｎｒａｔｃｅｒｖｉｃａｌｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎＩｎｃｕｂａｔｉｏｎｔｉｍｅ／ｄＡ５７０ｎｍＡｃｃｅｌｅｒａｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔ／％１０．４４±０．０７１０．１２０．５４±０．０９３４．４３０．６１±０．１０５２．０４０．５９±０．１４４７．５５０．５０±０．０９２６．６ＳｅｅＴａｂ１ｆｏｒｔｈｅｍｅｄｉｕｍ．珋ｘ±ｓ，ｎ＝６．Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１，ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅＡ５７０ｖａｌｕｅｏｆｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｏｎｄ１（０．３９８±０．０６６）．Ｔａｂ３．ＩｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｒｈＥＧＦｏｆｖａｒｉｏｕｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎｒａｔｃｅｒｖｉｃａｌｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｃｙｃｌｅｒｈＥＧＦ／μｇ·Ｌ－１Ｇ０／Ｇ１／％Ｓ／％Ｇ２／Ｍ／％Ｃｏｎｔｒｏｌ６８．５±２．６１８．０±２．４１３．５±２．００．１６３．６±３．２２３．０±３．０１３．５±２．４１６１．７±２．９２４．６±３．０１３．７±２．６１０５７．０±２．８２６．６±５．４１６．４±１．９１００５８．４±２．９２５．３±５．１１６．５±２．１ＲＣＥＣｗｅｒｅｓｅｅｄｅｄｉｎｔｏｔｈｅ３０ｍＬｃｕｌｔｕｒｅｂｏｔｔｌｅａｔａｄｅｎｓｉｔｙｏｆ１×