重组水蛭素的聚乙二醇修饰

重组水蛭素的聚乙二醇修饰李雪芹，候蓓蓓，赵军，田明玉，修志龙*大连理工大学环境与生命学院大连116024摘要：目的水蛭素因血浆半衰期短而严重限制了其临床应用，聚乙二醇修饰能有效地延长其半衰期。本文通过比较不同修饰位点、修饰方法所得单修饰产物的比率、纯度及其活性保留率，从而得到修饰专一性强且活性保留率较高的修饰策略。方法采用液相和固相修饰方法,用琥珀酰亚胺活化的PEG20kDa分别在pH6.0、8.0的条件下对水蛭素的His和Lys进行定点修饰；用SDS-PAGE分析产物的修饰度，并用离子交换柱对修饰后的产物进行分离，然后用凝血酶滴定法测定水蛭素单修饰产物的体外抗凝活性。另外用分子动力学模拟方法预测了pH8.0条件下PEG修饰的位点。结果在pH6.0、8.0的条件下，水蛭素单修饰率都高达90%以上，但二者的单修饰活性保留率相差较大。在pH6.0时，液、固相单修饰活性保留率为34%、34.8%；而在pH8.0时分别为55%、96%。结论在pH8.0条件下，采用“离子交换柱辅助”固相修饰的方法对Lys进行定点修饰能得到较高产率和较高活性保留率的单修饰产物。关键词：重组水蛭素；SC-mPEG；抗凝活力；分子动力学模拟PEGylationofRecombinantHirudinLiXueqin，HouBeibei，ZhaoJun，TianMingyu，XiuZhilong*DepartmentofBioscienceandBiotechnology,SchoolofEnvironmentalandBiologicalScienceandTechnology,DalianUniversityofTechnology,Dalian116024,ChinaAbstract:OBJECTHirudinisthemostpotentinhibitorofthrombinfoundinnature.Althoughhirudinhasthestrongestanti-thrombinactivityinvivo,itsshorthalf-lifeinserumsignificantlylimitsitsclinicalanticoagulantapplication.Currently,PEGylationiscommonlyusedasaneffectivemethodtoprolongitshalf-lifeinserum.OurobjectofexperimentistochoosethebestPEGylationmethodaccordingtothemonoPEGylatedrecombinanthirudin’spurityandtheanticoagulantactivityinvitro.METHODSSolutionmethodandsolidmethodassistedby“packed-bed”andanionexchangecolumnwereusedtofavortheformationofmono-PEGylatedhirudin.ThemildacidicandmildalkalinePEGylationstrategywasusedtotargetHisresidueandLysresidueofhirudinrespectivelyusingSC-mPEG20kDa.Thepegylatedproductswereisolatedbyanionexchangechromatogram.SDS-PAGEwasusedtoanalyzethepurityofPEGylatedhirudin.ThrombinmethodwasusedtoanalyzetheanticoagulantactivityofPEGylatedhirudin.MoleculardynamicsmodelingwasusedtojudgetheprobabilityofPEGylationsite.RESULTSThemono-PEGylatedproductwithapurityofmorethan90%wasobtainedatpH6.0andpH8.0.Butalargedifferenceinanticoagulantactivityexists:theanticoagulantactivityofsolutionandsolidmethodswere34%and34.8%respectivelyatpH6.0；55%、96%atpH8.0.CONCLUSIONSolidmethodassistedbyanionexchangecolumnatpH8.0wasabetterstrategytogetmono-PEGylatedr-Hirudin.Keywords：recombinanthirudin；SC-mPEG；anticoagulantactivity；moleculardynamicsmodeling前言水蛭素是含65个氨基酸残基与3个二硫键的多肽，分子量约7000，是迄今为止发现的特异性最好的凝血酶抑制剂[1],而凝血酶诱发的血液凝固是诱导血管血栓形成的重要原因，因此水蛭素对各种血栓病均有疗效。然而水蛭素有一些显著的药用缺点，如血浆半衰期较短，一般只有60-100分钟，患者需不断注射才能维持抗凝效果，导致治疗成本较高，且重复注射也会引起一些不良反应[2-4]。上世纪70年代以来，人们发现一些蛋白经过PEG修饰后，很多方面的药用特性大大改善。之后，人们开展了对于水蛭素的PEG修饰研究。GeorgeC.Avgerinos[5]等人采用基因工程方法对水蛭素氨基酸进行改造，用甲基营养酵母Hansenylapolymorpha特异性表达了只含两个Lys的水蛭素，采用对硝基碳酸酯活化的PEG5kDa进行修饰，并设计了工业等级纯化步骤。这种对水蛭素修改的方式可以大大提高修饰产物的专一性，但是研究周期性较长且须具备一定的科研条件。国内也有关于水蛭素PEG修饰的研究。于爱平[6]等人采用SPA-PEG5kDa修饰水蛭素II，采用SourceQ15离子交换柱凝胶柱分离修饰产物，发现三修饰产物活力大大降低，为原蛋白的33.5%。秦海娜[7]等人采用羰基二咪唑法活化的PEG5kDa修饰水蛭素，采用凝胶色谱方法崔修饰产物进行分离，虽水蛭素可与修饰产物分离，但是修饰产物之间未能分离开。本实验组旨在通过比较不同修饰位点、修饰方法所得单修饰产物的比率、纯度及其活性保留率来找到修饰专一性强且活性保留率较高的修饰策略。修饰位点选择了His和Lys；修饰方法选择了液相修饰和“填料辅助”、“离子交换柱辅助”两种固相修饰方法。1材料基因工程重组水蛭素（r-Hir）购自大连高新生物制药有限公司；水蛭素变异体2购自重庆科润生物医药有限公司；SC-mPEG20kDa购自北京键凯科技有限公司2实验方法2.1水蛭素His位点的PEG修饰2.1.1液相修饰HV2与SC-mPEG20kDa以摩尔比1:1溶于0.2MpH6.0磷酸盐缓冲溶液中（PBS），在25℃中反应1.5h。反应产物用HiTrapQHP进行线性梯度洗脱。2.1.2“填料辅助”的固相修饰在pH6.0下，将20mMPBS与r-Hir:SC-mPEG以摩尔比1:3在Q-SepheroseFF介质中充分反应，反应完成后装柱、梯度洗脱。2.2水蛭素Lys位点的PEG修饰2.2.1液相修饰HV2与SC-mPEG20kDa以摩尔比1:3溶于0.02MpH8.0PBS中，在23℃下反应。SC-mPEG分三等分三次加入，每次反应30min。反应结束后样品立即用HiTrapQHP进行线性梯度洗脱。2.2.2“离子交换柱辅助”的固相修饰4ml1.5mg/mlHV2溶液(溶于PBS20mM,pH8A液）与溶于4ml20mM,pH8PBS中的SC-mPEG先后以1ml/min的流速上样于柱中，使二者在柱中充分反应后进行在线梯度洗脱。3分析方法3.1SDS–PAGE参考文献[8]，15%浓缩胶、4%分离胶，采用含5%氯化钡的0.1M碘液对PEG进行染色。表1为水蛭素PEG各修饰产物的理论分子量，可结合电泳图确定洗脱组分成分。3.2生物活性测定参照文献[9]的方法，采用凝血酶滴定法。3.3组氨酸修饰产物含量检测利用SC-mPEG与r-Hir的His残基之间形成的氨基甲酸酯键对于中性羟胺的敏感性测定组氨酸修饰位置异构体的含量。3.4Lys修饰位点预测采用溶剂可及表面积作为判定赖氨酸残基修饰可能性的判断标准，运用分子动力学模拟的方法分析和预测液相和固相修饰的位点。4结果4.1水蛭素His位点的PEG修饰4.1.1液相修饰4.1.1.1修饰产物的分离纯化液相方法制备的PEG化水蛭素采用离子交换柱进行分离纯化、SDS-PAGE法进行组分鉴定。结合表1、图2可以推测出图1中峰1，2，3分别为二修饰产物、单修饰产物、单修饰产物。通过积分法计算出图1中各峰的面积，从而得出出各产物的比例：峰1：表1水蛭素PEG修饰产物组分理论分子量Table1TheestimatedmolecularweightsofthePEGylatedhirudin图1阴离子交换色谱分离修饰反应混合物（pH6.0）Fig.1SeparationofthePEGylationmixture(preparedatpH6.0)byanion-exchangechromatography图2修饰产物的电泳结果（15%-5%）Fig.2SDS-PAGEanalysisofPEGylatedr-hirudin.峰2：峰3=4.74%：94.6%：0.66%，可见单修饰产物是主要的修饰产物。4.1.1.2单修饰产物的体外抗凝活性测定采用凝血酶滴定法对修饰水蛭素进行活性检测。图3显示峰2相对于未修饰的r-hirudin其抗凝活性保留率为34%,而峰3的抗凝活性保留率为19.2%。峰2具有较高的抗凝活性保留率，并且是修饰反应的主产物（峰2占修饰反应产物的94.6%）,因此被选作本文的目标单修饰产物做进一步的分析。4.1.1.3His-修饰位置异构体含量测定利用SC-mPEG与r-Hir的His残基之间形成的氨基甲酸酯键对于中性羟胺的敏感性测定组氨酸修饰位置异构体的含量。图4中，峰2的79.71%被中性羟胺断开为r-Hirdin,表明His-修饰位置异构体含量为79.71%，是在0.2MpH6.0PBS中修饰反应的主要的成份。4.1.2“填料辅助”的固相修饰4.1.2.1修饰产物的分离纯化对在pH6.020mMPBS,r-Hir：SC-mPEG=1：3反应所得固相修饰产物，采用阶段洗脱的策略进行分离、SDS-PAGE法进行组分鉴定。图3重组水蛭素以及单修饰重组水蛭素的体外抗凝活性测定Fig.3Invitroanticoagulantactivityofr-hirudinandmonopegylatedr-hirudin图4组氨酸修饰位置异构体含量测定Fig.4TheproportionassayofHis-pegylatedpositionalisomer图5固相修饰反应混合物（pH6.020mMPBS,r-Hir:SC-mPEG=1:3）的分离纯化Fig.5Separationofthesolid-phaseassistedPEGylationreactionmixture(pH6.020mM,r-Hir:SC-mPEG=1:3)图6固相修饰反应混合物(pH6.020mMPBS,r-Hir:SC-mPEG=1:3)的纯化产物的电泳图谱Fig.6SDS-PAGEanalysisoftheseparationproductsofthesolid-phaseassistedPEGylationreactionmixture(pH6.020mMPBS,r-Hir:SC-mPEG=1:3)如图5所示，峰1为盐浓度突然增大造成的紫外吸收的波动，峰2经电泳检测,如图6所示，分子量为约27KDa，推断