目的基因的制备

2020/4/21第五章目的基因的制备第一节目的基因的制备第二节目的基因的分离2020/4/22一概述基因工程或DNA重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组中分离克隆目的基因。目的基因确定其表达调控机制和生物学功能建立高效表达系统构建具有经济价值的基因工程菌（细胞）体外进行必要的结构功能修饰输回细胞内改良生物体遗传性状，包括人体基因治疗2020/4/23二什么是目的基因基因工程的主要目的是使优良性状相关的基因聚集在同一生物体中，创造出具有高度应用价值的新物种。为此必须从现有生物群体中，根据需要分离出此类基因，即准备要分离、改造、扩增或表达的基因通常称之为目的基因。如抗逆性相关基因（抗病、抗寒等）、生物药和保健品相关基因、毒物降解相关基因、工业用酶等相关基因等。2020/4/24一般来说，目的基因的制备战略分为两大类一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。2020/4/2第一节目的基因的制备5第一节目的基因的制备1、直接法制备基因2、从基因组文库中钓取目的基因3、从cDNA文库中钓取目的基因4、通过PCR直接扩增出目的基因2020/4/261.1限制性核酸内切酶酶切分离法限制性内切酶酶切分离法适于从简单基因组（如质粒和病毒）中分离目的基因。①对已定序的DNA分子，只需用已知识别序列的限制性核酸内切酶进行一次或几次切割，分离纯化所需DNA片段，与适当载体重组后转化受体菌后即可得到目的基因的克隆。②对已知定位的目的基因，只要根据目的基因两侧的已知的限制性内切酶识别位点，用适当的限制性内切酶切割，一次就可获得目的基因。2020/4/27所谓基因就是具有特定生物学功能的一段核苷酸序列，所以只要掌握了其分子结构，完全可以在实验室进行人工合成。1977年，利用化学途径首次合成了编码脑激素的基因（生长激素释放因子基因），并在大肠杆菌中实现了成功的表达。从此，化学合成基因得到了很大的发展迅速。早期通过化学合成的部分基因基因人胰岛素转运RNA-干扰素肠促胰液肽尿抑胃激素-干扰素大小（bp）12654281162453合成年代197819791981198219821984基因视紫红质前脑菲肽ATP酶溶菌酶RNA酶T1RNA酶Ａ大小（bp）105777170385324375合成年代1985198519851985198619871.2化学法直接合成基因2020/4/281.2.1.1小片段粘接法：混合退火根据目的基因全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段T4-DNA连接酶连接克隆入合适的载体1.2.1化学合成法的基本战略全基因合成有三种战略：2020/4/29混合退火T4-DNA连接酶连接克隆入合适的载体Klenow酶聚合1.2.1.2补钉延长法根据目的基因两条互补链全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段以及20-30碱基长的单链DNA中片段2020/4/210根据目的基因的全序列，分别合成40-50碱基长的单链DNA片段混合退火T4-DNA连接酶连接克隆入合适的载体Klenow酶聚合1.2.1.3大片段酶促法2020/4/2111.2.1.4三种方法各有利弊化学合成DNA的单片段愈短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为95%则合成50个碱基长的DNA单链大片段的总收率只有7.7%2020/4/2121.2.2化学合成的单元操作化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：基团保护、分离、缩合、分离、去保护五大操作单元。从反应机理上来讲，DNA化学合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法；具体操作过程又有液相合成和固相合成两种形式。前者操作繁琐，基本上已淘汰；后者反应中间物的分离程序简便，DNA合成仪就是根据固相亚磷酸三酯法原理设计的2020/4/213OHGHHHHOCH2ODMTPOMeNCHMeMeCHMeMeOHGHHHHOCH2ODMTPOMeNCHMeMeCHMeMeH激活缩合氧化脱取代基玻璃珠化学合成的单元操作DMT：二甲氧基三苯甲基连接臂2020/4/214合成天然基因修饰改造基因设计新型基因制备探针、引物、接头1.2.3DNA化学合成的用途如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、干扰素基因等如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等2020/4/2第一节目的基因的制备15第一节目的基因的制备1直接法制备基因2从基因组文库中钓取目的基因3从cDNA文库中钓取目的基因4利用PCR直接扩增出目的基因2020/4/216对于高等真核生物而言，基因组DNA庞大，组成结构复杂，存在间隔序列和重复序列，因此，单个目的基因在整个基因组中所占的比例极其微小，大多数基因难以直接分离得到。为了解决这个难题，可行的方法就是将这个基因扩增，增加成功分离目的基因的可能性。但是由于要分离的目的基因往往是未知基因，因此无法对它进行特异性扩增,而只能对所有的基因进行扩增，也就是构建该生物材料的基因组文库。然后再根据不同的方法将所需的克隆筛选出来。2020/4/2第一节目的基因的制备172、从基因组文库中钓取目的基因2.1基因文库的构建2.1.1基因文库的基本概念基因库(genepool):特定生物体全基因组的集合（天然存在）基因文库(genelibraryorgenebank):从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式存在（人工构建）一个受体菌的群体之中,这个群体即为这种生物的基因文库。根据构建方法的不同，基因文库分为:基因组文库（含有全部基因）；cDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因）2020/4/2第一节目的基因的制备182.1.2基因文库构建的材料来源材料来自染色体DNA或mRNA在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA一般还有组织细胞的界定，如肝组织cDNA文库或胚胎组织cDNA文库等。很显然，cDNA文库的信息量远小于基因组文库种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种生物体的cDNA文库2020/4/2192.1.3基因文库的完备性基因文库的完备性是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示：其中：P=任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率，f=克隆片段的平均大小/生物基因组的大小N=ln(1–P)/ln(1–f)例如，人的单倍体DNA总长为2.9x109bp，基因文库中克隆片段的平均大小为15kb，则构建一个完备性为0.9的基因文库至少需要45万个克隆；而当完备性提高到0.9999时，基因文库至少需要180万个克隆2020/4/220Forexample:期望值为0.99，插入片断为20kb的E.coli(4.6×106bp)和human(3×109bp)基因组的克隆数的计算NE.coli==1.1×103ln(1-0.99)ln[1-(2×104/4.6×106)]Nhuman==6.9×105ln(1-0.99)ln[1-(2×104/3×109)]这个例子说明用质粒载体（插入片段5-10kb）就可以建立很好的原核生物基因文库，只需要几千个克隆；而真核生物则需要更大承载能力的载体。2020/4/2第一节目的基因的制备212.1.4基因文库的质量标准除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因文库应具备下列条件：重组克隆的总数不宜过大以减轻筛选工作的压力载体的装载量最好大于基因的长度避免基因被分隔克隆克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域以利克隆排序克隆片段易于从载体分子上完整卸下重组克隆能稳定保存、扩增、筛选2020/4/2222.1.5基因文库的构建技术路线①材料的选择及基因组DNA的制备；②载体的选择；③载体与基因组DNA的限制性酶切；④载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞；⑤重组克隆的筛选和保存。2020/4/2第一节目的基因的制备232.1.5.1基因组DNA的制备AAAA文库构建的DNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。制备的DNA分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末端的DNA片段的比率就越低，重组率和完备性也就越高用常规方法制备的染色体DNA的长度一般在100kb左右。如果先将细胞固定在低融点凝胶中，然后置入含有SDS、蛋白酶K、RNase的缓冲液中浸泡，可获得1000kb大小的DNA片段2020/4/2第一节目的基因的制备242.1.5.2载体的选择出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的l-DNA或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和人类）需使用YAC或BAC载体。由于绝大多数真核生物的mRNA小于10kb，因此用于cDNA文库构建的载体通常选质粒。上述几种载体的最大装载量如下：l-DNA质粒考斯质粒10kb23kb45kbBAC300kb用于基因文库构建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌2020/4/2第一节目的基因的制备252.1.5.3载体与基因组DNA的切割用于基因组文库构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是：第一保证DNA片段之间存在部分重叠区。第二保证DNA片段大小均一。超声波处理后的DNA片段呈平头末端，需加装人工接头。部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，这样DNA酶解片段的大小可控。连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级分离，以杜绝不相干的DNA片段随机连为一体。2020/4/2第一节目的基因的制备262.1.5.4载体与外源片段的连接（1）连接酶DNA连接酶；T4DNA连接酶；E.coliDNA连接酶它们都可以催化5’末端磷酸和3’末端羟基形成磷酸二酯键。但由于T4DNA连接酶既能连接粘性末端还能连接平末端，而E.coliDNA连接酶主要连接粘性末端，所以一般连接反应中都用T4DNA连接酶。2020/4/2第一节目的基因的制备27（2）连接反应的效率连接反应的效率和连接产物的组成与DNA末端的特性、DNA末端的浓度以及所用的连接酶量有关。平末端连接反应的效率相对较低，它需要较高浓度的平末端、较大的连接酶量、较低浓度的ATP以及不能有象亚精胺一类的多胺。在连接反应中加入15％的PEG8000或1～1.5pmol／L氯化六氨合钴等浓缩剂可极大地促进平末端反应的连接速度，同时可改变不同连接产物的比例，使连接产物增多。2020/4/2第一节目的基因的制备28（3）避免外源DNA片段之间的连接措施在基因组文库的构建过程中，最应引起重视的问题是：严禁外源DNA片段之间的连接！！！为了避免上述情况的发生，可采取下列措施的组合：将待连接的DNA片段根据载体的装载量分级分离用碱性磷酸单酯酶除去DNA片段的末端磷酸基团用酶在DNA片段的末端上增补同聚尾末端2020/4/2第一节目的基因的制备292020/4/2第一节目的基因的制备302.1.5.5重组DNA导入宿主及筛选转化转导转染感染结合其它2020/4/231密集铺板（1-10万）杂交挖取目的重组克隆铺板铺板2020/4/2第一节目的基因的制备32构建噬菌体基因组文库的主要步骤2020/4/2第一节目的基因的制备33用粘粒载体建立基因组文库的主要步骤2020/4/2第一节目的基因的制备342.1.5.6基因组文库重组克隆的排序大型基因文库（包括人的基因文库）的构建在技术上并不十分困难，如果一个YAC基因文库的插入片段总和为整个基因组的十倍以上时，一般就能从基因文库中调出任何一段DNA序列。然