国家自然科学基金结题报告

项目批准号31101022申请代码C0709归口管理部门收件日期    国家自然科学基金资助项目结题报告资助类别：青年科学基金项目亚类说明：附注说明：项目名称：CPK10基因调控拟南芥响应干旱胁迫的分子机制研究负责人：魏凤菊电话：[phone]电子邮件：[e-mail]依托单位：河北农业大学联系人：张永升电话：[phone]资助金额：22（万元）累计拨款：22.0（万元）执行年限：2012.01-2014.122015年01月16日填表日期：国家自然科学基金委员会制（2012年）NSFC-REPORT-2014Version：1.022.799项目摘要中文摘要(500字以内)：钙依赖型蛋白激酶（CDPKs或CPKs）是钙信号的重要传递体，拟南芥基因组编码34个CDPKs，其中大部分基因的功能及其参与的信号转导途径仍不清楚。申请人前期研究结果表明，拟南芥CPK10功能缺失突变体表现对干旱显著敏感表型，组织表达分析和气孔开度实验证明CPK10参与了气孔开放与关闭运动过程，这些结果初步表明CPK10通过调节气孔运动参与响应干旱胁迫的信号转导过程。本项目将在前期工作基础上，通过酵母双杂交筛选保卫细胞cDNA文库以及利用串联亲和纯化（TAP）技术寻找CPK10的互作靶蛋白，结合运用遗传学、蛋白质生物化学、细胞生物学等方法与技术，分析研究CPK10在体内参与调控气孔运动的作用，深入探讨拟南芥CPK10蛋白响应干旱信号转导过程的分子机制。此研究为进一步阐明植物的抗旱机制、为利用基因工程手段培育优良的植物抗旱新品种提供理论依据。拟南芥；蛋白激酶；干旱胁迫；AtCPK10；关键词：Abstract(limitedto1500characters)：Calcium-dependentproteinkinases(CDPKs)functionsasimportantcalciumsensorsinplantsandthereare34CDPKsinArabidopsisgenomealone.ThebiologicalfunctionsofmostCDPKsinstresssignalingremainunclear.Theapplicant'spreviousresultsshowedtheCPK10mutantexhibitedmoresensitivephenotypesinresponsetodroughtstressthanwildtype.ExpressionanalysisandstomatalapertureassaysdemonstratedthatCPK10wereinvolvedinstomatalopeningandclosuremovement.ThesedatapresentedthatCPK10,possiblyviaregulatingstomatalmovements,playsimportantrolesinresponsetodroughtstress.Basedonthepreviousresults,thefurtherstudyinthisprojectfocusedonidentifyingtargetprotein(s)ofCPK10andcharacterizingthefunctionofCPK10inresponsetodroughtstress.Yeast-twohybridinteractionscreeningfromguardcellcDNAlibrariesandtandemaffinitypurification(TAP)wereusedtoidentifiedCPKA10-interactingprotein(s),andgenetics,biochemistryandcytobilolgymethodswerefollowedtoanalysisthesubstratesfunctions.Theserusultswillfurtherfacilitatemoredetailinvestigationsintoplantresponstodroughtstress,andprovidedtheoriesforbreedingexcellentdrought-resistantlines.Arabidopsis; proteinkinase; droughtstress; AtCPK10; Keywords: NSFC-REPORT-2014第1页国家自然科学基金资助项目结题报告结题摘要中文摘要(对项目的完成情况及取得成果做简单概述，1000字以内)：拟南芥CPK10参与了干旱胁迫过程中对气孔运动的调节，本课题通过串联亲和纯化（TAP）技术寻找AtCPK10的互作靶蛋白，结合运用生物信息学、蛋白质生物化学、细胞生物学等方法与技术，对AtCPK10参与调控气孔运动的分子机制进行了初步研究。首先通过构建带有双标签（Flag和HA）的pCM1307-Flag-HA-AtCPK10双元表达载体，以农杆菌介导转化拟南芥野生型，筛选获得稳定表达的转基因T3代阳性材料；进而利用TAP技术筛选AtCPK10的互作蛋白，经质谱分析，获得316个蛋白，经生物信息学分析，挑选出9个感兴趣成员。通过RT-PCR方法分析在干旱诱导条件下候选基因转录水平的表达情况，结果显示CPK8、CAT3、HSC70-1受干旱诱导表达量明显增高，推测这些成员可能参与干旱逆境。蛋白质生化及细胞生物学实验证实CPK10和它们之间直接互作的工作正在进行。综合上述结果，本研究为探讨CPK10调节气孔运动的机制奠定了坚实的工作基础。同时对于认识CDPK家族成员之间的关系提供了重要的启示性线索。项目资助发表核心论文1篇，待发表两篇。培养硕士生3名，其中1名已经取得硕士学位，2名在读。项目投入经费22万元，支出19.6858万元，各项支出基本与预算相符。剩余经费2.3142万元，剩余经费计划用于本项目研究后续支出。TAP技术；AtCPK10；互作蛋白；表达变化；逆境分析关键词：Abstract(limitedto3000characters)：•ArabidopsisthalianaCa2+-dependentproteinkinase10(CPK10)wasinvolvedinregulationofstomatalmovmentsinresponsetodroughtstress.Usingtandemaffinitypurification(TAP)toscreeninteractingproteins.Combinedwithbioinformatics,proteinbiochemistryandcytobiologymethods,thepreliminaryfunctionalcharacterizationofAtCPK10inregulatingstomatalmovementswereresearchedinthisinvestigation.Firstly,thecDNAofCPK10wasclonedintovectorpCM1307-N-FlagandtransferredintoArabidopsisplants(wildtype),T3homozygouslineswereobtained.Andthen,TAPmethodswereappliedtoscreencandidateproteinsthatinteractwithCPK10.About348expressedproteinswereobtainedfromthemassspectrometry(MS)dataand9wereselectedwithcandidateproteins.RT-PCRanalysisshowedthatCPK8、CAT3、HSC70-1werehighlyexpressedinresponsetodroughtstress,thisresultdemonstratedthatthesecandidateproteinspossiblyinvolvedindroughtstress.TheaboveresultsnotonlylayasolidfoundationforelucidatingtheregulatorymechanismofAtCPK10onstomatalmovementsbutalsoprovidesinsightintounderstandingtherelationshipbetweenCDPKsmembers.Thereare1paperwaspublishedunderthesupportofNSFCandtwopaperswouldhavetowaittobepublished.Onestudentshaveobtainedmasterdegreeandtwoarepursuing.Totalinputfundwas220,000yuan.Totalexpenditurewas196,686yuan.Thesurpluswillbecontinuetospendonthisresearch.NSFC-REPORT-2014第2页国家自然科学基金资助项目结题报告TAPtechnology; AtCPK10; interactingproteins; expressionKeywords: analysis; stressanalysisNSFC-REPORT-2014第3页国家自然科学基金资助项目结题报告报告正文一、研究计划要点及执行情况概述。研究基本按照原计划执行，一些研究内容稍作调整。（1）检测了CPK10与HSP1蛋白的可能互作方式。通过酵母双杂交技术得出HSP1可以发生自身互作。在利用TAP（串联亲和纯化）技术结合质谱技术分析HSP1与CPK10的作用方式过程中，纯化获得的杂蛋白信号较强，试验未能顺利进行下去。（2）筛选了与CPK10可能互作的其它靶蛋白。分离保卫细胞并建立酵母cDNA文库，通过酵母双杂交技术筛选互作蛋白，获得的蛋白经测序分析多为持家基因表达产物，利用构建的保卫细胞酵母文库筛选CPK10互作蛋白的方法暂告一段。利用串联亲和纯化技术筛选CPK10可能的互作蛋白，再结合质谱分析技术测得蛋白的氨基酸序列，获得多个候选基因。（3）对靶基因是否参与干旱逆境进行了初步分析。检测靶基因受干旱诱导后的表达情况，组织及亚细胞表达情况。（4）初步检测了cpk10突变体材料中靶基因的表达情况，明确的试验结果有待重复。（5）获得了CPK10与CPK30的双突变体，初步进行了基因功能分析。二、研究工作主要进展和所取得的成果。（一）酵母cDNA文库的构建及筛选将一定数量的拟南芥第3、4轮莲座叶叶片剪下后洗净，放入匀浆机中，加入适量的冷蒸馏水，打磨成碎表皮条，用孔径为75μm滤膜过滤，去除含有大量叶肉细胞的液体，收集碎表皮条。将碎表皮条放入50mL烧杯中，加入适量酶解液I，22℃，110rpm振荡酶解1h左右。用孔径为75μm滤膜过滤，收集表皮条，加入适量酶解液II，22℃，110rpm振荡酶解2h。第二步酶解过程中，当在显微镜下观察到显微镜镜检发现视野中保卫细胞变圆成为原生质体，或脱落或以球状挂在气孔厚壁上，这类细胞占到总保卫细胞大约40%时停止酶解。将酶解液以移液器轻柔抽打几次以利于原生质体的脱落，然后将酶解液用20μm滤膜过滤，滤液在100g下离心1min，移去上部溶液，沉淀部分即为保卫细胞原生质体。1.大量保卫细胞的获得为了获得足够的有活力的原生质体，传统的通过撕取表皮酶解来获得原生质体的方法，不能满足某些实验大量需要保卫细胞原生质体的要求，于是，借鉴整片叶片打碎再酶解的方法[20]。取生长四周的拟南芥叶片约200片，4℃冷水中冰浴10min，转入含约600mL冷蒸馏水的匀浆机中打制约5~6次，速度约为8000~10000rpm，时间