RACE方法

实验步骤①cDNA第一条链的合成：ƒ我们建议进行cDNA合成的对照反应，这样可以对样品的cDNA的合成进行鉴定。加入各种试剂之后，在水浴中42度保温一个小时。注意：在水浴或酒精浴中保温会减少反应体积，从而降低第一链的合成效率。将管放于冰上，以终止第一链的合成反应。直接进行第二链的合成。②cDNA第二链的合成：第二链合成的酶混合物中，含有聚合酶、RNaseH和连接酶。T4DNA聚合酶的功能是补平dscDNA的末端。我们建议做阳性对照，试剂盒中提供人类骨骼肌的mRNA。ƒ建议进行阳性对照,cDNA的质量取决于制备的polyA+RNA的质量。非哺乳动物样品的mRNA大约在0.5－3kb之间。ƒ通过电泳检测cDNA的产量，与对照进行对比，这样可以有利于在以后的步骤中对cDNA进行稀释。接头的连接及连接产物的稀释ƒ按照程序进行连接反应。ƒ如果没有对比样品和对照的产量，利用Tricine－EDTAbuffer制备接头连接的dscDNA的1/50和1/250的稀释物，用两种稀释物进行以下的RACEPCR反应，直到鉴定出哪一种稀释可以得到好的效果。RACE－PCR扩增·进行5’和3’的RACE－PCR扩增。·利用以下的程序进行降落PCR反应：94度30秒5个循环：94度5秒72度4分钟5个循环：94度5秒70度4分钟20－25个循环：94度5秒68度4分钟注意：我们建议使用降落PCR反应，这就要求GSP的Tm值≥70度。当循环结束时，利用1.2%琼脂糖凝胶电泳分析每一个管中的产物5μl，使用适当的分子量marker。·可以根据你的基因的特异性来设计最理想的循环参数。如果看不到带或者只有微弱的带，在68度多加5个循环。最佳的延伸时间取决于扩增条带的长度。如果片断的长度在2－5kb的时候，经常使用4min，0.2-2kb的时候将延伸时间减到2－3min，对于5－10kb的条带，延伸时间增加到10min。③RACE产物的验证：{应该对RACE的片段进行验证,以此来确定是否已经扩增了理想的产物。如果得到的是多条带或者研究的是多基因家族的成员，验证是非常有用的。有3种验证RACE产物的方法：（1）比较由GSP和NGSP获得RACE产物。（2）Southernblot（3）克隆并测序{我们建议最好测得RACE产物的部分序列。有的时候需要嵌套引物的存在。比较由GSP和NGSP获得RACE产物。{对于5‘末端的RACE产物，比较由AP1和GSP1扩增出来的产物和由AP1和NGSP1扩增出来的产物。{对于3‘末端的RACE产物，比较由AP1和GSP2扩增出来的产物和由AP1和NGSP2扩增出来的产物。这对于鉴定多条带是否是上一个PCR的特异性产物是非常有用的。{如果条带是正确的，在嵌套PCR反应中的条带应该是略微小一些。基本PCR和嵌套PCR产物的迁移率的不同取决于cDNA结构中GSP1和嵌套引物的位置。④RACE产物的克隆和测序：{可以利用胶回收试剂盒来回收RACE产物，此试剂盒适合回收2.5kb以下的RACE产物；对于长的片段，可以通过电洗脱获得好的结果。如果你选择使用其他的纯化方法，最后用Tricine－EDTAbuffer30μl重新悬浮DNA样品。{电泳5μl回收的样品来鉴定回收的质量。{将回收的PCR产物直接克隆到/A型的PCR克隆载体中。另外还可以利用接头和/或cDNA合成引物中的Not1、Srf1、Xma1、ECOR1等酶切位点，将产物克隆到常规载体中对于5‘端的RACE产物，我们建议挑取至少8－10个不同的克隆以获得5‘端的最大可能性的序列。（反转录并不总是进行到mRNA模板的5’末端，尤其是长模板。另外，T4DNA聚合酶会移走5‘末端的0－20个碱基。）{一旦鉴定了含有插入片断的克隆，应该获得多的序列信息。理想的是，可以对整个开放读码框进行测序。包括5‘和3‘的非翻译区。全长cDNA的获得{通过部分或全部测序鉴定了RACE产物后，可以通过两种选择获得全长的cDNA。通过PCR的方法。通过克隆的方法。通过PCR的方法获得全长cDNA：„扩增长的cDNA需要较长的延伸时间，但是如果延伸的时间过长，可以产生拖带，所以要慎重的设计引物。„根据从5‘和3‘RACE产物获得序列信息设计5’和3‘GSP引物。这些引物应该来自cDNA的3’或者5‘的末端，应该是23－28nt长。不应该在引物的末端加上限制性位点，这样会导致高背景。在某些时候可以设计3’和5‘的嵌套引物。但是还是应该先利用一对引物进行PCR反应。通过PCR的方法获得全长cDNA：„进行如下的热循环：94度30秒25个循环94度5秒72度2－15分钟„延伸的时间应该等于预期的cDNA长度加上2分钟。例如：预期得到6kb的条带，用6+2=8分钟的延伸时间。„注意：如果没有条带或者条带弱，增加5个循环；或者优化PCR的条件。通过PCR的方法获得全长cDNA：„在1.2%的琼脂糖凝胶上分析5μl的样品。通常情况下，可以见到一条单一带，如果这样，利用胶来纯化全长的cDNA。„制备1.2%的TAEbuffer制备琼脂糖凝胶。不使用TBEbuffer，TBE的胶很难制备全长的cDNA。„将剩下的45μl反应物点样，选用适当的marker。„利用长波紫外观察cDNA（≧300nm）切下全长的cDNA。注意：应该尽量减少紫外对cDNA的照射。通过PCR的方法获得全长cDNA：„利用胶回收试剂盒回收cDNA。此试剂盒适合回收2.5kb以下的RACE产物；对于长的片段，可以通过电洗脱获得好的结果。如果你选择使用其他的纯化方法，最后用Tricine－EDTAbuffer30μl重新悬浮DNA样品。„将全长的cDNA克隆到T/A型的PCR克隆载体中。通过克隆产生全长的cDNA：z如果你已经获得了含有重叠部分的5‘和3’RACE产物，同时在cDNA的重叠部分含有一个酶切位点的话，通过克隆技术可以获得全长的cDNA。z利用酶切获得的3‘和5’扩增产物，并且利用T4DNA连接酶将它们连接起来。利用接头和cDNA合成引物中的内切酶将最终的全长cDNA克隆到载体中。z在哺乳动物基因组中，NOT1和Srf1酶切非常稀少，大约106bp才出现一次，因此在绝大多数的cDNA中是不出现的。Appendix：cDNA接头和引物z接头在设计的时候可以使cDNA的扩增成功进行：z接头的5‘端在第一个循环中没有AP1引物的结合位点。AP1的结合位点只有通过GSP的扩增之后才能够产生。z这些特点中的每一个都可帮助减少cDNA片段扩增过程中出现的非特异性扩增。另外，它们允许从一个复杂的DNA片段的混合物中扩增出靶样品――所有的产物都有相同的末端结构，因为使用了单一的一套GSPs。