细胞融合技术

《细胞工程》1细胞融合技术【摘要】细胞工程是四大生物工程中的一种,其中细胞融合技术则是细胞工程的关键技术。人们对细胞融合机理和融合方法的了解越来越多,在实践应用中的范围也越来越广。细胞融合技术作为细胞工程的一项核心基础技术已在农业、医药、环保等领域得到了迅速发展和应用。该技术的不断发展和改进，一方面表现在融合剂上,另一方面则体现在新用法上,并且也体现在融合对象的不断扩展上。现在新的细胞融合技术方法正在尝试着将各种物理和化学手段综合应用,使细胞融合的方法、手段向操作更为简便,易于量化研究,同时又能够使融合率向不断提高的方向发展。本文对细胞（包括植物细胞、动物细胞、微生物细胞）融合的机理、方法以及细胞融合技术的应用进行了简单的综述。【关键词】细胞融合方法应用【正文】1、细胞融合的机理和意义1.1细胞融合的机理最近的研究表明,细胞融合与病毒和细胞之间融合以及细胞内的膜泡融合有许多的相似之处,即带有包被的病毒(或细胞)通过转膜病毒的蛋白介导与宿主中细胞的细胞膜进行融合。I类病毒融合蛋白包括:流感病毒红血球凝集素(HA)和人类免疫缺陷的病毒包被蛋白,它们都拥有相似的结构域,即都具有a螺旋结构。病毒和细胞两者之间正是通过这些蛋白完成融合过程(伴随有构象的变化)。细胞内的膜泡融合也是一样,它的相关融合蛋白包括GTPases和SNAR家族。因此推测细胞融合采用相似的机理。然而细胞融合蛋白并不是全具有a-螺旋结构,提示的a-螺旋并非融合所必需。1.2细胞融合的意义所谓细胞融合就是指在外力(诱导剂或促融剂)作用下，两个或两个以上的异源(种、属间)细胞或原生质体相互接触，从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现象称为细胞融合或细胞杂交。如取材为体细胞则称体细胞杂交，体细胞融合后可形成四倍体或多倍体细胞，由此形成的杂交细胞，其特性会有很大的变化。细胞融合不受种属的局限，可实现种间生物体细胞的融合，使远缘杂交成为可能，因而是改造细胞遗传物质的有力手段。它的意义在于从此打破了仅仅依赖有性杂交重组基因创造新种的界限和生殖壁垒，极大地扩大了遗传物质的重组范围；细胞融合技术避免了分离、提纯、剪切、拼接等基因操作，在技术和仪器设备上的要求不象基因工程那样复杂，投资少，有利于广泛开展研究和推广，有着《细胞工程》2重大的实践意义，正得到科学界的日益重视。经过长期反复研究和实践，细胞融合技术逐步发展和完善起来，已成为生物工程的基础技术之一。特别是近20年来，从理论和实践两个方面，有力地推动了生物科学各领域的发展。细胞融合方法得到了不断的更新，融合率也得到逐步的提高。2细胞融合的方法2.1生物法自从研究者发现活的仙台病毒可以在体内介导癌细胞融合后,人们又实现了用灭活的病毒促使动物异种细胞融合,从而跨越了细胞融合种属屏障,推动了细胞融合技术跃上了新台阶。解决病毒制备的困难、操作复杂和灭活病毒效价的差异等问题是用病毒诱导细胞融合一种新的研究方向。2.2化学法2.2.1盐类融合法。此法是应用较早的诱导原生质体的融合方法。盐类的融合剂对原生质体的破坏很小。今后的研究应提高其融合率,使其对液泡化高的的原生质体能够诱发融合。2.2.2聚乙二醇融合法(PEG法)。加拿大籍华人高国楠(1974)用聚乙二醇(PEG)试剂为融合剂诱导大豆与大麦、玉米与大豆、哈加野豌豆与豌豆的融合。此法比病毒更容易制备和控制,活性也较稳定,用PE试剂作为病毒的替代物诱导细胞的融合。在PEG试剂诱导细胞融合的有效浓度范围内(50%~55%)对细胞的毒性应该进一步减小。2.3物理法2.3.1激光融合技术。1987和1989年德国的海德堡理化研究所采用了准分子激光器让油菜原生质体融合,从开始光照到完成融合仅需要几秒钟。该法可选择在任意两个细胞进行融合,易于实现特异性的细胞融合,作用于细胞的应力小,定时定位性较强,损伤小,参数也易于控制,操作方便,并可利用监控器清晰的观察整个细胞融合过程,实验重复性液好,无菌无毒性,但是它只能逐一的处理细胞。2.3.2离子束细胞融合技术。《细胞工程》320世纪80年代科学家证实了离子注入生物的效应和粒子沉积生物的效应的存在,建立了质量、能量和电荷三因子作用的机制体系,根据这原理发展了该技术。离子束可操纵性高,可利用微束对融合细胞进行超微加工,有目的性地切割染色体,通过消除部分的染色体或染色体某些片段来达到细胞非对称融合的目的[5]。该项研究一旦研究成功,必将改变传统一对一细胞融合的劣势,并可减少供体细胞导入的染色体的范围,使该融合更具有目的性,从而大大减少了筛选的工作量,这将是细胞融合研究的又一大进步。3、细胞融合的应用3.1动物细胞融合技术动物细胞融合是从细胞水平来改变动物细胞的遗传性，用于生产单克隆抗体、疫苗等特定的生物制品，改良培育动物新品种，缩短动物的育种过程。动物细胞融合的应用范围已广及生物学的各个分支学科，特别是在绘制人类基因图谱方面取得了显著成绩。虽然细胞杂交属于理论生物学范畴，但在实际应用方面也有重大突破。在基础理论研究上，动物细胞融合技术对研究细胞分化、基因定位、肿瘤发生机制等方面都有重要意义。在实际应用方面，动物细胞融合技术在药物定向释放系统、细胞治疗以及抗肿瘤免疫等方面起到重要的作用。动物体细胞杂交技术主要应用于以下几个方面。3.1.1用于基因定位和绘制人类基因图谱JP2杂种细胞中某一染色体或其片段的存在与否与细胞的某一性状表达与否相联系，从而可以实现把基因定位于某一染色体或某一区段上。1967年Weise和Green发现在人和鼠的融合细胞中，人的染色体优先丢失，并证明利用这一特点有可能对人染色体上的基因进行定位。1970年Ruddle等开始系统地用融合细胞作为实验系统来绘制人类基因图。3.1.2用于生产树突状细胞抗肿瘤疫苗一般认为肿瘤细胞表面抗原不能诱导强的免疫应答反应，树突状细胞（dendriticcells,DCs）与肿瘤细胞融合形成的树突状细胞疫苗能够有效地激发机体的细胞免疫应答，无论是在动物研究还是在人体早期临床试验中都证明这是一种方便、安全、可行的方法。并且由于融合细胞可以在体内存活，因此可以维持较长时期的免疫应答，有利于诱发机体产生有效的抗肿瘤免疫。肿瘤抗原可以肽《细胞工程》4段或完整蛋白的形式与DCs结合，或者将肿瘤抗原基因转化进DCs中，使其内源性地表达抗原，这两种方法在抗肿瘤免疫应答中均有效，但适于免疫的肿瘤抗原及其基因难以鉴定从而限制了其应用，有实验证明用这两种方法制备的肿瘤疫苗的免疫原性不及肿瘤细胞与树突状细胞直接融合的异核细胞，融合细胞保持了DCs和肿瘤细胞的特性，并且能高效地将未知的肿瘤抗原提呈给免疫系统，今后肿瘤疫苗的研究工作将集中在疫苗的纯化上，以期用高度纯化的杂合细胞来激发更为有效和强烈的免疫应答反应，使得这种方法在临床应用中更为实际。3.1.3用于生产单克隆抗体使小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合形成能产生单克隆抗体（monoclonalantibody,McAb）的杂交瘤细胞，单克隆抗体具有专一性和灵敏性，作为理论研究的工具在病原检测和疾病治疗以及食品安全领域具有广阔的应用前景。1985年，中科院上海细胞生物学研究所研制成功抗北京鸭红细胞和淋巴细胞表面抗原的单克隆抗体，同时还与有关医学部门合作，成功地制备了抗人肝癌和肺癌的单克隆抗体。在神舟四号上我国自制的细胞电融合仪分别进行了植物细胞的电融合试验和动物细胞的电融合试验，动物细胞电融合实验采用纯化的乙肝疫苗病毒表面抗原免疫的小鼠B淋巴细胞和骨髓瘤细胞，目的是获得乙肝单克隆抗体。目前有关单位利用McAb作用的专一性这一特点正在探索用“生物导弹”对癌症进行早期诊断和治疗。3.1.4用于动物育种体细胞核移植技术（somaticcellnucleartransfertechnique,SCNT）是将细胞核移植到另一细胞的细胞质中的生物技术。动物体细胞融合后，杂种细胞难以发育再生为一个个体，但借助于细胞核移植的方法将融合后杂种细胞的细胞核移入去核成熟卵内，可培育新的杂种。另外，细胞核移植技术的建立，还为目前进行的哺乳动物体细胞克隆和转基因技术打下良好的实验基础。3.1.5用于细胞疗法SCNT将患者的任何体细胞与去核卵细胞融合，融合子进行有丝分裂形成囊胚，囊胚的内细胞团是多能干细胞，对多能干细胞进行诱导使其定向分化可形成所需的组织和器官用于器官移植，不仅解决了器官和组织来源问题，并且也避免了宿主对外来物的免疫排斥。《细胞工程》53.1.6动物体细胞融合在基础理论研究方面的应用（1）用于研究细胞的核质关系和个体发育。20世纪70年代初，诞生了细胞拆合工程。Carter于1967年发现细胞松弛素B（CB）能诱发体外培养的小鼠L细胞的排核作用。Prescott等1972年首先应用离心术结合CB分离哺乳类细胞的胞质体获得成功，为研究哺乳类细胞的核、质相互关系、细胞质基因的转移开创了新的途径。异核体和细胞杂合子被用来确定基因调节因子，这些调节因子决定一个细胞表型消失或得以保持以及赋予受体新性状；通过对供体和受体细胞所有细胞特异性基因表达研究，细胞融合有助于人们了解发育，特别是在研究基因编码的可逆性方面。在个体发育过程中，血红蛋白存在着从胚胎型向胎儿型（幼虫）最终向成人型的转换，对这些转换进行研究，除了揭示基因顺序表达的调控机理外，在医学方面也有意义，人们可以部分或全部扭转从胚胎型向胎儿型的转变从而治疗镰刀型贫血病。（2）用于揭示疾病发生的机制。与其他技术结合使用，细胞融合是一种揭示疾病机理的有效方法。例如，细胞融合与免疫荧光，生化分析，电镜技术相结合，LattanziG等对肌肉萎缩症发生的机理进行了研究。（3）用于膜蛋白动力学研究。细胞融合技术与显微镜技术结合使用被用来研究膜蛋白动力学以及这些膜蛋白之间的关系，PéterNagy等的研究发现大型膜蛋白群之间(主要组织相容性复合物majorhistocompatibilitycomplex,MHC，包括MHCⅠ和MHCⅡ）发生蛋白质交换，并且群内蛋白之间也发生蛋白移位，小蛋白群之间也存在着蛋白重排现象。3.2植物细胞融合技术3.2.1植物细胞融合技术目前主要是作为扩大变异的手段，同时也正朝着将抗药性和胞质雄性不育等细胞质基因导人另一个体细胞的方向发展，有可能形成新的核质杂种。如果获得了有用性状的细胞系，在还不能形成植株时，就可以通过快速大量繁殖细胞加以利用。3.2.2在生产应用研究方面，植物细胞融合在育种上有重要的应用价值，通过诱导不同种间、属间甚至不同科间原生质体的融合，可能打破有性杂交不亲和性的界限，广泛地组合各种基因型，从而有可能形成有性杂交方法所无法获得的新型杂种植株；另一方面又可将各种细胞器、DNA、质粒、病毒、细菌等外源遗《细胞工程》6传物质引入原生质体，从而有可能引起细胞遗传性的改变，为某些珍稀植物的快速繁殖、植物的复壮等提供了可行的方法，应用于植物育种、种质保存、无性系的快速繁殖和有用物质生产等。3.2.3植物细胞融合配合常规育种技术，可望选出优良材料，加之体细胞杂交来自双亲的遗传物质并非简单的堆积，而是发生了复杂的遗传重组，这正是改良作物所期望的。植物细胞融合的作用主要表现在以下方面：通过植物细胞融合培育抗病新材料；合成新的物种，转移细胞质基因。3.2.4原生质体新培养体系的研究将会提高融合率。YamagishiH等设计了一种新的高效原生质体培养体系，增加了不对称杂交属内种间细胞融合率。可以设想,细胞融合技术发展后,可以把人参和虫草的细胞融合,产生新的品种,并具备它们各自特有的药效，这是非常有意义的事。3.3微生物细胞融合技术3.3.1用于植物和微生物育种是细胞融合技术最基本的应用领域。对微生物而言，该技术主要用于改良微生物菌种特性、提高目的产物的产量、使菌种获得新的性状、合成新产物等。与基因工程技术相结合，使对遗传物质进一步修饰提供了各种各样的可能性。目前，微生物细胞融合的对象已扩展到酵母、霉菌、细菌、放线菌等多种微生物的种间以至属间，不断培育出用于各种领域的新菌种。自1979年匈牙利的Pes