gateway重组技术

河南农业大学牧医工程学院1Gateway基因克隆Gateway基因克隆是由Invitrogen公司在二十世纪九十年代末发明并应用于分子生物学基因克隆的一项专利技术。该技术利用专有的重组序列使得DNA片段能够更有效地被转入质粒当中，可应用于大片段的基因克隆，并且在保持正确阅读框的前提下让不同表达载体间的DNA转移成为可能。这一技术在插入的目的DNA片段两端整合attL1和attL2两个侧端重组序列，来构建一个类似通道的结构并称之为“入门克隆”（GatewayEntryClone）。据Invitrogen宣称Gateway技术使用99%有效且可逆的一小组重组反应，如此使得基因克隆不同于传统的限制性内切酶方法，避免了目的片段内存在切点的问题而使得大片段DNA保持其完整性，大大提高了克隆效率，常应用于大规模的DNA片段整合进同一种表达载体，因此又称之为高通量基因克隆技术（GatewayCloningTechnology）。一、Gateway基因克隆的原理及机制Gateway被视为一种克隆操作平台：把目的基因克隆到入门载体（EntryVector）后，就不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在的特定重组位点和重组酶，高效、快速地将目的基因克隆到其它的受体载体（DestinationVector，目的载体）上。Gateway的原理是建立在噬菌体DNA定点整合到细菌宿主基因组上。在噬菌体和细菌的整合因子（INF、Int）的作用下，lambda的attP位点和大肠杆菌基因组的attB位点可以发生定点重组，lambda噬菌体DNA整合到大肠杆菌的基因组DNA中，两侧产生两个新位点：attL和attR。这是一个可逆的过程，如果在一个噬菌体编码蛋白Xis和IHF、Int的共同介导下这两个新位点可以再次重组回复为attB和attP位点，噬菌体从细菌基因组上裂解下来（见图1）。这一过程的方向是受控于两个重要因素：存在的介导蛋白和重组位点。图1、噬菌体位点专一性重组的机制在Gateway系统中,入门载体包含两个重组位点序列attL1和attL2，大小均为100bp，中间夹着一个自杀基因——ccdB基因。由于ccdB基因的表达产物能抑制普通的E.coli生长，在克隆时没有切开或者自身环化的载体在转化时不能生长。在构建含目的基因的入门载体时必须切掉这个基因，接入目的基因。ccdB基因两端可以选择的酶切位点有限（2个），同时还必须考虑读码框架、启动子、终止密码等问题，因此Gateway系统提供了5种不同的入门载体以供选择。需要特别注意的是转化用的菌株必须是不含F附加体的，因为它表达的一种产物能阻断ccdB基因，影响筛选结果。同样，目的载体（DestinationVector）也必须和Gateway系统配套，即目的载体的表达调控元件下游有两个重组位点attR1和attR2，大小均为125bp，同样也夹着一个ccdB自杀基因。当需要将目的基因从入门载体（EntryVector）转移到目的载体（DestinationVector）时，只要将两种质粒混合（线性化能有效提高重组率），加入含有Int、IHF、Xis等重组因子的LR重组酶混合物，attR2序列和attL2序列发生重组，生成一个融合质粒。attL1序列再和attR1序列重组，融合质粒分解为两个新的质粒，目的基因与原来位于目的载体上的自杀基因发生重组置换，得到一个带目的基因的目的载体（生成新的重组位点attB1、B2）和带自杀基因的入门载体（生成新的重组位点attP1、P2，见图2）。由于带自杀基因的载体不能生长，加上抗生素筛选，转化产物重组率高达90%以上。图2、gateway机制由于在这个反应中attL1序列只和attR1序列重组，attL2序列只能与attR2序列重组，这个方向的反应称为LR反应。LR反应生成新的位点称为attP1/2（200bp）和attB1/2（25bp）序列。在一定的条件下，attP和attB序列也能发生重组，生成attL和attR序列，这个反向反应称为BP反应（见图3）[1]。图3、BP反应及LR反应当用户得到一个含目的基因的Gateway表达载体，希望将目的基因转移到另外几个Gateway表达载体中时，只要先将目的基因从Gateway表达载体中转移到入门载体上，在由入门载体转移到其它的表达载体就行。将含目的基因的Gateway表达载体（attB1—目的基因—attB2序列）与带有attP1-ccdB(自杀基因)-attP2序列的供体载体（pDONR，注意这个载体不同于入门载体EntryVector）混合，加入含有Int、IHF的BP重组酶混合物，attP和attB序列也能发生重组，生成带有目的基因的入门载体（EntryVector）和带自杀基因的表达载体。同样，由于抗性不同以及自杀基因的作用，只有含目的基因的入门载体能被筛选出来。这即是BP反应。需要特别注意的是表达载体如果也是卡那霉素抗性，就必须选择另外一个供体质粒以便筛选。二、Gateway基因克隆优点Gateway技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统（图4）。这项强大的体外技术大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤，而同时典型的克隆效率高达95%或更高。当基因在目的表达载体之间快速简便的穿梭时，还可以保证正确的方向和阅读框。Gateway也有助于进行带不同数目纯化和检测标签蛋白的表达。图4Gateway技术的灵活性Gateway利用了位点特异重组，所以在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶。一旦您拥有了一个入门克隆，就可以多次使用它，转移的目的基因到Gateway改造过的各种表达载体（目的载体）。此外，由于在重组时DNA片段的阅读框和方向保持不变，因而，不必再为新的表达克隆测序担心。在使用每一种新的表达系统时，将会节省更多的时间。三、Gateway在构建cDNA入门文库和表达文库方面的应用2006年，中国科学院张宁，以激活蛋白产生菌一交链孢菌为材料，用基于入噬菌体特异位点重组反应构建定向cDNA文库的Gateway技术，首次成功构建了交链孢菌cDNA入门文库和表达文库。构建的cDNA入门文库经检测，入门文库的滴度达到6X108文库总容量为5.6X107，其阳性克性率为100%,平均插入片段大小大约为1.53Kb。通过LR重组把入门文库转换为表达文库。表达文库的滴度为1.53X106，文库总容量为6.2X106，其阳性克性率为100%，平均插入片段大小大约为1.62Kb。快速、高效的构建了高质量的cDNA入门文库和表达文库，为从分子水平进一步研究蛋白激发子提供了基础。通过大规模的免疫筛选文库获得激活蛋白全长编码基因，并进行表达与纯化，为进一步研究激活蛋白与植物受体的相互作用机理及信号途径奠定了基础[2]。四、Gateway在植物双分子荧光互补（BiFc）系统上的应用2013年，周洁等充分利用Gateway技术高效快捷的优势，构建了一套基于Gateway的BiFC分析载体系统。该系统和常规的系统一致，采用融合黄色荧光蛋白(yellowfluorecentprotein,YFP)片段的方法进行互作分析。其中的YFP片段被分为N端YFP(N-terminalYFPnYFP)片段和C端YFP(C-terminalYFP,cYFP)片段。该系统包括用于目的基因N端融合的nYFP载体和cYFP载体，及目的基因C端融合的nYFP和cYFP共4个载体。同时，还构建了带氨节青霉素(Ampicillin,Amp)抗性的入门载体，用于入门克隆。该入门载体可由实验室自行酶切制备，并且采用TA克隆的方法进行入门载体的构建，从而大大降低了创制入门克隆的成本。此外，该入门载体带有ccdB自杀基因，常规分子生物学实验室的制备手段就能保证非常低的背景克隆。总体而言，其构建的BiFC载体系统，操作简单且成本低，能够快速构建互作分析用的BiFC载体，高效的进行基因互作研究[3]。参考文献：[1]李明，丁博，牛有雄，等.小麦TaWRKY46-1基因克隆及建立在Gateway技术上的可诱导表达载体的构建[J]，华北农学报,2011,26(2)[2]张宁.交链孢菌cDNA文库构建及激活蛋白基因克隆与融合表达[D].中国农业科学院.2006[3]周洁，王栩鸣，陈斌，等.基于Gateway技术的低成本植物双分子荧光互补分析系统[J].浙江农业学报，2013,25(5);1024-1030.