基因工程10基因组研究技术.ppt

第十二章基因组研究技术基因组研究技术的核心内容：从不同层次上对基因组全部或某一区段遗传信息的有序性排列方式以及它们对应功能的揭示。第一节基因组遗传图谱的构建遗传作图（geneticmapping）：对某个未知真核生物基因组中的遗传信息（或是控制某个性状的基因）在染色体上的位置和分布状况进行初步确定。它是采用遗传学分析方法将基因或其他DNA序列标定在染色体上使之成为一条条有标识的“公路”。•经典遗传图谱人们把单倍体配子所有染色体上的全部基因称为一个基因组。基因组内每条染色体上的连锁基因称为一个连锁群。绘制遗传图谱就是要进行每条染色体上基因座位的顺序和距离的确定，即主要通过家系分析，对不同性状之间、性状与标记之间、标记与标记之间的连锁遗传频率进行计算，最终绘制遗传连锁图。人类遗传图谱包括女性一种配子的23条染色体(记作23，X)和男性两种配子的23条染色体(23，X)、(23，Y)上的所有基因位点。•现代遗传图谱70年代发展起来的DNA重组技术、DNA克隆技术和DNA探针技术无疑为拓展遗传图谱的构建途径创造了技术条件，也使人类基因定位的方法从细胞及染色体水平过渡到分子水平。DNA水平的多态性标记位点作为绘制现代遗传图谱的主要界标，大大提高图谱的精确度、准确性。遗传图谱的绘制也因此进入了一个崭新的时代。现代遗传图谱的概念是由BotsteinD等(1980)首先提出的，在此基础上，限制性片段长度多态性RFLP作为遗传图谱的第一代崭新标记得以问世。遗传图谱的第二代标记位点是大量的可变数量串联重复（VNTR)，包括微、小卫星(MS)或短串联重复(STR或SSLP)。第三代标记是位点极其丰富的单核苷酸多态性(SNP)。一、遗传作图标记凡是位于染色体上易于检测识别、在不同个体之间存在变异而且可以稳定遗传的位点都可以作为遗传作图的标记。形态标记分子标记遗传作图标记形态标记在经典遗传学中，每个相对性状都由一个不同的等位基因（allele）控制。但这些可见的表型性状十分有限，当多个基因影响同一个性状时，精细的遗传作图分析则陷入困境。因此，要构建高分辨率的遗传图，就必须有数量极其丰富的遗传标记。每一段具有专一遗传性状和功能的DNA被称为基因。一对染色体中两条染色单体上相同位置的DNA片段，就是一对等位基因。每对等位基因的性状有显性和隐性之分。拟等位基因(pseudoalleles)：表型效应相似,功能密切相关,在染色体上的位置又紧密连锁的基因。它们象是等位基因,而实际不是等位基因。分子遗传标记（DNA标记）凡是满足遗传标记特征的一段DNA序列都可以被发展成为DNA标记，DNA标记所在的遗传位点必须有不同等位基因，特定个体相应的基因型可以通过实验手段很容易检测出来。由于DNA标记类型丰富，数量众多，因而已经成为遗传作图的主要工具。分子遗传标记是指利用分子生物学的方法来区分不同的个体或群体,并且可以稳定遗传的物质或性状,是生物个体或群体间遗传差异的客观表征。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。•限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）定义：就是用限制性内切酶降解从生物中提取的总DNA，经凝胶电泳分离这些降解的小片段，再通过southern印迹转移到滤膜上，然后用放射性标记的探针与滤膜上的DNA杂交，洗去多余的杂交探针，永久性滤膜经放射性自显影就可发现与探针杂交的DNA限制性片段。不同的限制性内切酶，不同来源的DNA及标记的探针就会有不同的结果组合，利用这些不同的组合就可以构建RFLP分子标记图谱。简单地说就是DNA经限制性酶切后产生的DNA片段组成状态，涉及片段的多少和大小。对不同的物种来说，相当于形成了由DNA片段多态性组成的指纹。RFLP是第一种被用于作图研究的DNA标记。用RFLP进行基因定位原理：EcoRI例：－GAATTC－切点减少－GAGTTC－－CTTAAG－切点增加－CTCAAG－mRNA:GAAGAG谷aa谷aa优点：高效、可靠、可在一个反应内检测大量的限制性片段；缺点：需用同位素或非同位素标记引物，较费时、耗材而且单个探针位点少，鉴别效率不高。ABAB限制性内切酶位点与放射性探针结合部位①限制性内切酶酶切后；②电泳分离DNA片段；③转移至硝酸纤维素薄膜；④与放射性探针杂交，⑤分析阳性条带•简单序列长度多态性(simplesequencelengthpolymorphism,SSLP）产生于重复顺序的可变排列，同一位点重复顺序的重复次数不同表现出ＤＮＡ序列的长度变化。小卫星序列：重复单位的长度为数十个核苷酸。微卫星序列：重复单位的长度为1～6个核苷酸，有10～50个重复单位串联组成。分散在基因组中，大多不存在于编码序列内，具有较高的多态性。目前微卫星DNA已经发现了２万余个位点。TTCAGCTAGCTCAGCAGCAGCAGCAGCAGAGCTTGCAAGTCGATCGAGTCGTCGTCGTCGTCGTCTCGAACG微卫星DNAPCR扩增结果（示例）：500bp400bp300bp240bp该结果显示在所检查的人群中，该位点多态性有4种。SSR标记的主要特点:（1）数量丰富，广泛分布于整个基因组；（2）具有较多的等位性变异；（3）共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子；（4）实验重复性好，结果可靠；（5）由于创建新的标记时需知道重复序列两端的序列信息，因此其开发有一定困难，费用也较高。•单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP）1.定义单核苷酸多态性(SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。不同个体间，基因组DNA某部位的单核苷酸的变异。1996年，Lander报道了用SNP制备第三代遗传连锁图的遗传标记。2.SNP在人类基因组中出现的频率SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达1700万个甚至更多。ThereisoneSNPinevery1000basesleadstoanestimatethatanytwoindividualsdifferbyuptothreemillionSNPs.在基因组DNA中，任何碱基均有可能发生变异，因此SNP既有可能在基因序列内，也有可能在基因以外的非编码序列上。总的来说，位于编码区内的SNP(cSNP)比较少，因为在外显子内，其变异率仅及周围序列的1/5。但它在遗传性疾病研究中却具有重要意义，因此cSNP的研究更受关注。3.SNP检测方法★根据DNA列阵的微测序法；★动态等位基因特异的杂交；★寡聚核苷酸特异的连接；★DNA芯片以及TaqMan系统等。但不管哪一种方法，首先必须进行靶序列的扩增，然后才能进行其它检测。4.SNP用作遗传标记的优点•SNP在人群中是二等位基因性的，在任何人群中其等位基因频率都可估计出来。•它在基因组中的分布较微卫星标记广泛得多。•与串联重复的微卫星位点相比，SNP是高度稳定的，尤其是处于编码区的SNP(cSNP),而前者的高突变率容易引起对人群的遗传分析出现困难。•部分位于基因内部的SNP可能会直接影响产物蛋白质的结构或基因表达水平，因此，它们本身可能就是疾病遗传机制的候选改变位点。•易于进行自动化分析，缩短了研究时间。日本学者发现糖尿病基因的个人SNP差别日本研究人员最近经过研究发现，与糖尿病有关的基因并不是千篇一律，它们之间存在着个人差别，即“单核苷酸多态性”（SNP）。预计今后SNP将在下列领域发挥重要作用：(1)进行简单和复杂疾病的遗传连锁分析(linkageanalysis)及关联分析(associationanalysis),用于疾病易感基因定位；而且其定位的精度将比微卫星标记精细得多，可直接用于指导易感基因克隆。(2)在“药物基因组学”(pharmacogenomics)研究中，可通过检测SNP的遗传多态性标记揭示人群中不同个体对不同药物的敏感性差异的根本原因。(3)也可用于法医研究的罪犯身份的鉴别、亲子鉴定等，此外在器官移植中供体和受体间的配对选择及物种进化的研究中都将具有重要意义。二、遗传作图的方法１、遗传作图的遗传学原理遗传图绘制主要依据的是经典的孟德尔遗传学的连锁和交换定律。减数分裂时，同源染色体彼此靠拢，同源区段并排形成双联体。在双联体中，并列的染色体臂在等价的位置DNA交换或DNA重组。因交换的频率与在染色体上所间隔的距离成正比，重组率则可成为衡量基因之间相对距离的尺度。通过重组率可判断基因在染色体上的相对位置，从而绘制遗传图。２、不同模式生物的连锁分析对于不同的模式生物可采用有性杂交实验连锁分析以及系谱分析作图进行遗传作图。对于细菌来说由于不发生减数分裂，可通过使DNA片段从一个细胞转移到另一个细胞的频率来测定遗传距离，如转化、转导和接合转移。第二节基因组物理图谱的构建一、限制性作图在基因组上标定限制性酶切位点的相对位置。主要适合对小基因组的原核生物和大片段进行限制性位点分析。二、DNA大片段重叠克隆的基因组作图重叠克隆的基因组作图是先构建基因组的大片段基因文库，然后根据克隆片段之间的重叠顺序构建重叠群，从而绘制物理连锁图。覆盖基因组某一区域的若干具有一定重叠的DNA区段所组成的片段群，称为重叠群。描述代表完整染色体片段的大片段重叠克隆的排列顺序的图谱称为重叠群图谱。三、荧光标记原位杂交作图荧光标记原位杂交是通过荧光标记的探针与染色体杂交，从而确定分子标记在染色体上的实际物理位置。在细胞分裂中期染色体处于高度浓缩状态，有可分辨的染色体带型及明显的着丝粒位置，通过测定原位杂交所显示的荧光信号所处的位置与染色体短臂末端的相对距离，经过比例换算可将分子标记标定在连锁图上。简单地说，就是利用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与抗原标记的探针分子特异性的结合来检测DNA序列在染色体上的位置。原位杂交技术的基本步骤：•制备探针；•染色体制片；•染色体处理与变性；•染色体与探针杂交；•显微检测。荧光标记探针检测精子染色体专一位点探针四、序列标签位点作图序列标签位点作图通过PCR或分子杂交将序列标签小段DNA序列在基因组DNA中进行定位。可用于构建最为详细的大基因组物理图。序列标签位点是一小段长度在100-500bp的单拷贝DNA序列，当DNA大片段含有同一STS序列时，说明这两个片段彼此重叠，根据重叠关系可以逐段绘制DNA的物理图。第三节基因组测序（略）第四节基因组功能分析一、鉴定基因组序列中的基因１、通过序列分析查找基因•寻找基因的开放阅读框（openreadingframe）;该方法对简单的细菌基因组很有效。•通过网上序列比对，寻找基因的同源性。2、基因确定的实验技术•分子杂交检验某一片段是否含有表达序列•cDNA测序有助于基因鉴定•确定转录本末端•异源双链分析•外显子捕获（exontrapping）外显子捕获寻找外显子时需要一个有两个已知外显子及插入其中的一个内含子组成小基因载体，且第一个外显子前面有真核启动子。将所研究的基因组DNA片段插入载体内含子区域，然后导入合适的细胞进行表达，转录产生的RNA再进行剪切。如果将大量基因组片段插入该载体中构建成外显子捕获文库，将文库表达后利用上述引物进行RT-PCR扩增获得大量片段并测序，理论上可以确定出一个基因组上所有的外显子序列。二、基因功能的确定1、利用生物信息学分析基因功能就是以同源检索为基础，通过把待鉴定的DNA序列或氨基酸序列与数据库中所有的已知序列进行比较所获得的相似性来发现新基因和推测相应的功能。•基因失活（基因敲除）•基因超量表达探索基因功能•基因编码的蛋白质功能的深入研究2、用实验分析确定基因功能反向遗传学：获得基因组序列之前研究基因功能是从表型开始，确定控制表型相关基因及其序列，但到获得基因组序列之后则需要从未知功能的基因序列开始，确定它对应的功能和相关的表型，即反向遗传学。三、基因组功能体现蛋白质组（proteome）：指由一个细胞，一个组织或一种生物的基因组所表达的全部