第7章微生物的生长及其控制2015

第七章微生物的生长及其控制本章内容目录•第一节微生物生长的测定•第二节微生物的生长•第三节环境对微生物生长的影响•第四节微生物的纯培养技术•第五节微生物生长繁殖的控制生物个体物质有规律地、不可逆增加，导致个体体积扩大的生物学过程。生长：生物个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。繁殖：生长是一个逐步发生的量变过程，繁殖是一个产生新的生命个体的质变过程。在高等生物里这两个过程可以明显分开，但在低等特别是在单细胞的生物里，由于细胞小，这两个过程是紧密联系又很难划分的过程。一个微生物细胞合适的外界条件，吸收营养物质，进行代谢。如果同化作用的速度超过了异化作用个体的生长原生质的总量（重量、体积、大小）就不断增加如果各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，引起个体数目的增加。群体内各个个体的进一步生长群体的生长群体生长=个体生长+个体繁殖个体生长→个体繁殖→群体生长在一定时间和条件下细胞数量的增加（微生物群体生长）微生物生长:在微生物学中提到的“生长”，一般均指群体生长，这一点与研究大生物时有所不同。第一节微生物生长的测定单位时间里微生物数量或生物量（Biomass）的变化微生物生长：微生物生长的测定：个体计数群体重量测定群体生理指标测定评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响；评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制(或杀死)作用的效果；客观地反映微生物生长的规律；p1511、直接计数法1）常规方法：显微镜直接计数法采用细菌计数板或血球计数板，在显微镜下对微生物数量进行直接计数（计算一定容积里样品中微生物的数量）。缺点：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数（一）细胞数的测定通常用来测定细菌、酵母菌等单细胞微生物的生长情况或样品中所含微生物个体的数量（细菌、孢子、酵母菌）2）其它方法：将已知颗粒浓度的样品（例如血液）与待测细胞细胞浓度的样品混匀后在显微镜下根据二者之间的比例直接推算待测微生物细胞浓度。比例计数：过滤计数：当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器。然后将滤膜干燥、染色，并经处理使膜透明，再在显微镜下计算膜上(或一定面积中)的细菌数；活菌计数：采用特定的染色技术也可分别对活菌和死菌进行分别计数1、直接计数法（一）细胞数的测定1）平板菌落计数法参见沈萍P153；微生物学实验P28，207－208每毫升原菌液活菌数＝同一稀释度三个以上重复平皿菌落平均数×稀释倍数×5取0.2mL若平均数为159，则159×103×5=7.95×105菌落形成单位/mL2、间接计数法采用平板菌落计数法要求操作熟练、准确，否则难以得到正确的结果：样品充分混匀；每支移液管及涂布棒只能接触一个稀释度的菌液；同一稀释度三个以上重复,取平均值；每个平板上的菌落数目合适，便于准确计数；一个菌落可能是多个细胞一起形成，所以在科研中一般用菌落形成单位（colonyformingunits，CFU）来表示，而不是直接表示为细胞数。2）膜过滤培养法当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器，然后将将膜转到相应的培养基上进行培养，对形成的菌落进行统计。参见沈萍P153；微生物学实验P28，212－2133）最大概率法（Themostprobablenumbermethod）本法适用于含菌量少的样品或一些在固体培养基上不易生长的细菌样品的测定.如测定土壤微生物中特定生理群的数量和检测污水、牛奶及其它食品中特殊类群的细菌数量。缺点：只能进行特殊生理群的测定，结果也较粗放对未知样品进行十倍稀释，然后根据估算取三个连续的稀释度平行接种多支试管，对这些平行试管的微生物生长情况进行统计，长菌的为阳性，未长菌的为阴性，然后根据数学统计计算出样品中的微生物数目。参见微生物学实验P209－212•另一种MPN测定法•是将未知样品在定量培养液中进行一系列稀释培养。在一定稀释度以前的培养液中出现细菌生长，而在这个培养液中不出现细菌生长。将最后3级有菌生长的稀释度称为临界级数，以3-5个临界级数求得MPN，可以计算出样品体积中细菌数的近似值。例如,某一细菌在稀释中生长情况稀释度10-310-410-510-610-710-8重复数555555出现生长的管数555410取“541”查统计分配表，得近似值为17，则原菌液中的活菌数为17×10-5=1.7×10-5个/ml参见杨苏声，周俊初微生物学P164－165（二）细胞生物量的测定1、比浊法在一定波长下，测定菌悬液的光密度，以光密度(opticaldensity,即O.D.)表示菌量。实验测量时应控制在菌浓度与光密度成正比的线性范围内，否则不准确。2、重量法以干重、湿重直接衡量微生物群体的生物量；通过样品中蛋白质、核酸含量的测定间接推算微生物群体的生物量；测定多细胞及丝状真菌生长情况的有效方法蛋白质总量＝含氮量×6.25细胞总量＝蛋白质总量÷(50-80%(或65%))=蛋白质总量×1.543、生理指标法微生物的生理指标，如呼吸强度，耗氧量、酶活性、生物热等与其群体的规模成正相关。样品中微生物数量多或生长旺盛，这些指标愈明显，因此可以借助特定的仪器如瓦勃氏呼吸仪、微量量热计等设备来测定相应的指标。常用于对微生物的快速鉴定与检测第二节微生物的生长微生物的特点：个体微小肉眼看到或接触到的微生物是成千上万个单个的微生物组成的群体。微生物接种是群体接种，接种后的生长是微生物群体繁殖生长。对细菌群体生长规律的了解是对其进行研究与利用的基础一、细菌的群体生长——生长曲线生长曲线(GrowthCurve)：细菌接种到定量的液体培养基中，定时取样测定细胞数量，以培养时间为横座标，以菌数为纵座标作图，得到的一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线。在微生物学中提到的“生长”，均指群体生长。参见P153一、生长曲线细菌的生长曲线一般用菌数的对数为纵坐标作图一条典型的生长曲线至少可以分为迟缓期，对数期，稳定期和衰亡期等四个生长时期一、生长曲线迟缓期(Lagphase)：将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即增加，或增加很少，生长速度接近于零。也称延迟期、适应期。迟缓期的特点：分裂迟缓、代谢活跃细胞形态变大或增长，例如巨大芽孢杆菌，在迟缓期末，细胞的平均长度比刚接种时长6倍。一般来说处于迟缓期的细菌细胞体积最大细胞内RNA，尤其是rRNA含量增高，合成代谢活跃，核糖体、酶类和ATP的合成加快，易产生诱导酶。对外界不良条件反应敏感。细胞处于活跃生长中，只是分裂迟缓在此阶段后期，少数细胞开始分裂，曲线略有上升。迟缓期出现的原因：微生物接种到一个新的环境，暂时缺乏分解和催化有关底物的酶，或是缺乏充足的中间代谢产物等。为产生诱导酶或合成中间代谢产物，就需要一段适应期。调整代谢迟缓期的长短与菌种的遗传性、菌龄以及移种前后所处的环境条件等因素有关，短的只需要几分钟，长的需数小时。在生产实践中缩短迟缓期的常用手段：(1)通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短；(2)利用对数生长期的细胞作为种子；(3)尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大；(4)适当扩大接种量一、生长曲线对数生长期(Logphase)：又称指数生长期(Exponentialphase)以最大的速率生长和分裂，细菌数量呈对数增加，细菌内各成分按比例有规律地增加，表现为平衡生长。对数生长期的细菌个体形态、化学组成和生理特性等均较一致，代谢旺盛、生长迅速、代时稳定，所以是研究微生物基本代谢的良好材料。它也常在生产上用作种子，使微生物发酵的迟缓期缩短，提高经济效益。在细菌个体生长里，每个细菌分裂繁殖一代所需的时间为代时(Generationtime)，在群体生长里细菌数量增加一倍所需的时间称为倍增时间（Doublingtime)。代时通常以G表示。G=（t1-t0）／n=（t1-t0）／3.322（logNt－logN0）纳米细菌（nanobacteria），三天才分裂一次；九十年代初期从地下数公里发现的超微型细菌，用代谢产生的CO2作指标，计算出这些超微菌的代谢速率仅为地上正常细菌的10-15，有人认为它们需要100年才能分裂一次。一、生长曲线稳定生长期又称恒定期或最高生长期，此时培养液中活细菌数最高并维持稳定。稳定生长期(Stationaryphase)：由于营养物质消耗，代谢产物积累和pH等环境变化，逐步不适宜于细菌生长，导致生长速率降低直至零(即细菌分裂增加的数量等于细菌死亡数)。细胞重要的分化调节阶段；储存糖原等细胞质内含物，芽孢杆菌在此阶段形成芽孢或建立自然感受态等。也是发酵过程积累代谢产物的重要阶段，某些放线菌抗生素的大量形成也在此时期。生产上常通过补充营养物质（补料）或取走代谢产物、调节pH、调节温度、对好氧菌增加通气、搅拌或振荡等措施延长稳定生长一、生长曲线衰亡期(Decline或Deathphase)：营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累，细菌死亡速率超过新生速率，整个群体呈现出负增长。该时期死亡的细菌以对数方式增加，但在衰亡期的后期，由于部分细菌产生抗性也会使细菌死亡的速率降低，仍有部分活菌存在。细菌代谢活性降低，细菌衰老并出现自溶，产生或释放出一些产物，如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。细胞呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊，有些革兰氏染色反应阳性菌变成阴性反应等。不同的微生物或同一种微生物对不同物质的利用能力是不同的。有的物质可直接被利用(例如葡萄糖或NH4+等)；有的需要经过一定的适应期后才能获得利用能力（例如乳糖或NO3-等）。前者通常称为速效碳源（或氮源），后者称为迟效碳源（或氮源）。当培养基中同时含有这两类碳源（或氮源）时，微生物在生长过程中会形成二次生长现象。一、生长曲线由于采用活菌计数比较麻烦，并要求严格进行操作，否则不易得到准确的结果，重复性也差，因此在实际工作中多采用分光光度计测定OD值的方法绘制细菌的生长曲线。二、同步培养同步培养(Synchronousculture)：使群体中的细胞处于比较一致的，生长发育均处于同一阶段上，即大多数细胞能同时进行生长或分裂的培养方法。以同步培养方法使群体细胞能处于同一生长阶段，并同时进行分裂的生长。同步生长：通过同步培养方法获得的细胞被称为同步细胞或同步培养物参见P153二、同步培养同步培养物常被用来研究在单个细胞上难以研究的生理与遗传特性和作为工业发酵的种子，它是一种理想的材料。机械方法离心方法过滤分离法硝酸纤维素滤膜法环境条件控制技术温度培养基成份控制其他（如光照和黑暗交替培养）解除抑制法二、同步培养硝酸纤维素滤膜法是最经典的获得同步生长的方法由于细胞的个体差异，同步生长往往只能维持2-3个世代，随后又逐渐转变为随机生长。三、连续培养将微生物置于一定容积的培养基中，经过培养生长，最后一次收获。分批培养（batchculture）or封闭培养（closedculture）培养基一次加入，不予补充，不再更换。连续培养(Continousculture）在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法。培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物是实现微生物连续培养的基本原则。参见P157三、连续培养控制连续培养的方法恒浊连续培养不断调节流速而使细菌培养液浊度保持恒定恒化连续培养保持恒定的流速三、连续培养（一）恒浊连续培养测定所培养微生物的光密度值自动调节新鲜培养基流入和培养物流出培养室的流速使培养物维持在某一恒定浊度当培养室中的浊度超过预期数值时，流速加快，使浊度降低；当培养室中的浊度低于预期数值时，流速减慢，使浊度升高；恒浊培养器的工作精度是由光电控制系统的灵敏度来决定的如果所用培养基中有过量的必需营养物，就可以使菌体维持最高的生长速率。三、连续培养（一）恒浊连续培养一般