第十九章临床常见标本的细菌学检验

《微生物学检验》国家卫生和计划生育委员会规划教材微生物学检验《微生物学检验》国家卫生和计划生育委员会规划教材第十九章临床常见标本的细菌学检验返回总目录本章内容第一节概述1第二节临床常见标本的细菌学检验2学习目标：掌握临床常见标本的采集、送检和处理的原则临床常见标本细菌学检验程序、检验方法及结果报告熟悉TAT、危急值在临床实际工作中的应用临床标本常见病原菌的检验方法及鉴定要点了解临床标本细菌学检验的临床意义临床标本中正常菌群的分布及常见致病菌本章重点：★病毒标本采集和运送原则★病毒学诊断及鉴定常用方法★病毒培养的基本操作学习目标及重点第一节概述一、临床标本的采集、送检与处理原则（一）临床标本的采集1.核对检验单信息♦信息完整、无误2.选择适当的容器3.早期采集♦使用抗菌药物前4.无菌采集♦严格无菌操作技术第一节概述5.选择采集部位和方法第一节概述6.充足的标本量♦足量、适量7.标记标本8.归放标本♦符合生物安全防护要求第一节概述（二）临床标本的保存和送检♦立即送检，否则应放入运送培养基或保存液中运送1.普通细菌培养标本♦室温：1小时，4℃：24小时，运送培养基：48小时2.苛养菌培养标本♦保温、保湿送检，“床头接种”第一节概述3.厌氧菌培养标本♦防干燥，避免接触空气。4.安全运送♦注意安全防护♦高致病性传染病标本，按生物安全有关规定包装，由专人运送第一节概述（三）临床标本的处理♦核对标本与申请单信息常见标本处理方式•组织：无菌粉碎研磨后，加生理盐水制成悬液，接种•体液：3000r/mim离心10分钟后，接种。•棉拭子：置运送培养基送检，避免污染。•粪便：挑取带脓、血及黏液部分接种。•痰液：检查标本是否有血液、脓液、颗粒、干酪样物等•血液：采集后立即增菌培养•厌氧菌培养：检查标本、运送方式是否适合厌氧培养，立即接种第一节概述二、培养基及培养方法的选择1.培养基选择恰当的培养基或组合第一节概述电热恒温培养箱二氧化碳培养箱厌氧培养箱2.常用培养方法♦需氧培养、二氧化碳培养和厌氧培养第一节概述三、细菌学检验的基本流程（一）细菌学检验的基本程序第一节概述（二）细菌学检验鉴定步骤1.标本性状观察♦颜色、是否粘稠、是否浑浊、是否脓性、是否带血等性状第一节概述革兰染色抗酸染色墨汁染色2.涂片检查♦不染色标本检查：检查细菌的动力♦染色标本检查第一节概述3.细菌的分离培养♦目的：得到单个纯菌落♦甄别污染菌方法①观察菌落是否在划线上②观察菌落是否与直接涂片染色结果相符③观察菌落是否符合拟培养细菌的生长特点④注意培养时间第一节概述4.细菌的鉴定♦选择细菌检验鉴定方法的原则★选择有鉴定价值的试验：两种细菌出现不同的结果★选择快速、简易的试验：如触酶、氧化酶★综合考虑试验的敏感性和特异性第一节概述5.细菌对抗菌药物敏感性试验♦纸片扩散法♦肉汤稀释法♦自动化仪器法♦E-test法等。第一节概述返回本章内容四、细菌学检验报告原则♦标本周转时间（TAT）：从标本采集起到临床医生收到检验结果的时间♦危急值：指危及到患者生命健康安全的检验结果检验报告原则♦初报告♦预报告♦最终报告♦报告抗菌药物敏感性试验结果第一节概述一、血液及骨髓标本的细菌学检验（一）标本的采集1.皮肤消毒♦严格执行三步法2.采血部位：♦肘静脉♦肘动脉或股动脉采血♦婴幼儿采颈静脉血第二节临床常见标本的细菌学检验3.采集方法♦严格无菌操作4.采血量♦比例：1:10♦成人8～10ml/瓶♦儿童1～5ml/瓶♦婴儿1～2ml/瓶♦骨髓1～2ml/瓶第二节临床常见标本的细菌学检验疾病24小时内24小时后菌血症、败血症2～3份细菌性心内膜炎3份（1～2小时）2份不明原因发热2～3份2份5.采血时间和頻度6.标本的运送和保存立即送检，室温保存，切勿冷藏第二节临床常见标本的细菌学检验（二）微生物学检验1.常见病原菌第二节临床常见标本的细菌学检验2.检验程序第二节临床常见标本的细菌学检验培养基性状改变疑似病原菌均匀混浊，指示剂变色革兰阴性杆菌微混浊，有绿色变化肺炎链球菌有菌膜，均匀混浊有绿色荧光铜绿假单胞菌上层澄清，下层有沉淀链球菌细胞层自上而下的溶血溶血性链球菌混浊、有胶冻状凝固现象葡萄球菌灰白色菌膜、培养基清晰枯草芽孢杆菌或类白喉棒状杆菌3.检验方法（1）普通细菌的培养与鉴定♦增菌培养：培养阳性指证及疑似菌列表第二节临床常见标本的细菌学检验阳性培养瓶直接药敏试验分离培养涂片染色镜检细菌鉴定药敏试验报告报告报告♦阳性培养瓶处理♦阴性培养瓶处理于12～18小时、第3天和第7天至少做3次盲传，7天无细菌生长报告阴性第二节临床常见标本的细菌学检验（2）特殊细菌培养与鉴定♦脑膜炎奈瑟菌血液骨髓胰胨肉汤或专业培养瓶巧克力培养基（35℃,5％～10％C02）鉴定：葡萄糖、麦芽糖发酵阳性药敏：CLSI标准脑膜炎奈瑟菌菌落第二节临床常见标本的细菌学检验（2）特殊细菌培养与鉴定♦草绿色链球菌血液骨髓血琼脂平板（35℃,5％～10％C02、需氧和厌氧环境）胰酶解酪蛋白大豆肉汤培养瓶鉴定药敏试验草绿色链球菌草绿色链球菌菌落7天培养无细菌生长，培养至第4周，仍无细菌生长则报告“经4周培养无草绿色链球菌生长”第二节临床常见标本的细菌学检验血液骨髓葡萄糖胆汁或胆盐肉汤MAC、SS35℃培养鉴定;KIA、生化反应、血清学试验等药敏试验血液骨髓肝浸液肉汤肝浸液平板或血平板（35℃,5％～10％C02）涂片、生化鉴定血清学试验♦伤寒沙门菌及其他沙门菌♦布鲁菌培养4周无细菌生长，报告“经4周培养无细菌生长”第二节临床常见标本的细菌学检验标本牛心脑浸液或肝浸液血平板或巧克力平板35℃、厌氧培养生化鉴定♦厌氧菌♦真菌：真菌增菌肉汤增菌→沙保弱培养基（25℃或37℃）→菌落特征→生化鉴定、报告♦L型细菌高渗液体培养基→血琼脂平板和L型细菌培养基→典型“油煎蛋”菌落→返祖、鉴定第二节临床常见标本的细菌学检验4.结果报告采取分级和限时报告制度♦初报告：将镜检结果电话通知主管医生♦预报告：6～8小时内报告直接药物敏感结果♦最终报告：报告细菌种属、药敏试验、结果评价及建议♦阴性报告第二节临床常见标本的细菌学检验（三）临床意义♦排除杂菌污染，从血液和骨髓标本中检出任何细菌都具有临床意义♦葡萄球菌是血液感染最常见的细菌♦草绿色链球菌是亚急性心内膜炎的主要致病菌♦尿路、胆道、胃肠道炎症粘膜损伤引起的败血症以大肠埃希菌多见♦产单核李斯特菌主要引起新生儿败血症第二节临床常见标本的细菌学检验互动讨论草绿色链球菌属人体正常菌群，试分析从血液和痰液标本中分离出草绿色链球菌各有何临床意义？第二节临床常见标本的细菌学检验二、脑脊液标本的细菌学检验（一）标本的采集1.采集部位♦腰椎穿刺法2.采集量♦3～5ml3.标本的运送和保存♦15分钟内送检，最迟不能超过1小时。疑似苛养菌感染时，应保温送检第二节临床常见标本的细菌学检验（二）微生物学检验1.常见病原菌第二节临床常见标本的细菌学检验2.检验程序第二节临床常见标本的细菌学检验肺炎链球菌脑膜炎奈瑟菌流感嗜血杆菌3.检验方法（1）涂片检查♦革兰染色第二节临床常见标本的细菌学检验♦抗酸染色♦墨汁负染色新型隐球菌结核杆菌第二节临床常见标本的细菌学检验（2）分离培养与鉴定♦普通细菌标本→血琼脂平板和巧克力平板（35℃，CO2环境）→可疑菌落→形态、生化试验及血清学试验、药敏试验♦结核分枝杆菌标本→罗-琴培养基或米氏7H-10培养基→35℃温箱孵育→可疑菌落→鉴定第二节临床常见标本的细菌学检验♦真菌标本→血平板或沙保弱培养基→25℃及37℃孵育→可疑菌落→形态、镜检及生化反应等鉴定。♦厌氧菌标本→血平板、厌氧血琼脂平板和硫乙醇酸钠肉汤→35℃需氧、厌氧培养→可疑菌落→染色镜检及生化鉴定、药敏试验第二节临床常见标本的细菌学检验4.结果报告♦初报告：报告标本直接涂片结果♦预报告：报告标本直接药敏试验结果♦最终报告：报告细菌种属、药敏试验、结果评价及建议♦阴性报告第二节临床常见标本的细菌学检验（三）临床意义♦脑膜炎奈瑟菌引起细菌性脑膜炎♦结核分枝杆菌引起的结核性脑膜炎♦真菌性脑膜炎最常见的病原体是新型隐球菌，白假丝酵母菌、球孢子菌好发于免疫功能低下和恶性疾病患者第二节临床常见标本的细菌学检验三、尿液（泌尿生殖道）标本的细菌学检验（一）标本的采集1.中段尿采集法2.导尿法3.膀胱穿刺采集法4.集尿法5.标本的运送和保存♦立即送检、及时接种♦室温不超过2小时，4℃不超过8小时♦淋病奈瑟菌感染尿液标本不能冷藏第二节临床常见标本的细菌学检验（二）微生物学检验1.常见病原菌第二节临床常见标本的细菌学检验2.检验程序第二节临床常见标本的细菌学检验3.检验方法（1）涂片检查♦普通细菌检查：取沉淀涂片、染色、镜检♦淋病奈瑟菌检查第二节临床常见标本的细菌学检验♦念珠菌检查♦结核分枝杆菌检查：应与耻垢分枝杆菌相鉴别♦钩端螺旋体检查：暗视野显微镜下，发现一串细密亮珠、两端呈钩状且沿纵轴旋转运动的螺旋体时，报告找到螺旋体第二节临床常见标本的细菌学检验）接种尿量（菌落数ml（2）尿液细菌计数♦计算：cfu/ml=菌落数×稀释倍数或cfu/ml=♦意义革兰阳性球菌大于104cfu/ml,革兰阴性杆菌大于105cfu/ml，应考虑为泌尿系统感染）接种尿量（菌落数ml第二节临床常见标本的细菌学检验淋球菌菌落（3）分离培养与鉴定♦普通细菌培养：沉淀物→血平板和麦康凯平板→35℃培养→菌落观察→染色镜检、生化反应、抗菌药物敏感试验♦淋病奈瑟菌培养：标本→TM或MTM平板→35℃、5％～10％CO2环境→疑似菌落→涂片镜检、生化反应鉴定第二节临床常见标本的细菌学检验4.结果报告♦初级报告：标本涂片染色镜检结果，如“找到革兰阴性双球菌，存在于细胞内（外），形似淋病奈瑟菌”♦最终报告：报告细菌种属、菌落计数、药物敏感性试验、结果评价及建议♦阴性报告：48小时无细菌生长者，报告“48小时培养无细菌生长”第二节临床常见标本的细菌学检验（三）临床意义♦尿液中细菌数少于104cfu／ml或104～105cfu/ml之间，反复多次查出同一细菌时，一般也认为是病原菌。♦同份尿液中检出三种或以上不同微生物，应认为标本采集或处理不当被污染。♦尿液细菌学检查结果，应结合临床考虑综合第二节临床常见标本的细菌学检验直肠肛拭子四、粪便标本的细菌学检验（一）标本的采集1.自然排便法♦脓血、黏液粪便2～3克2.直肠拭子法♦成人4～5厘米♦幼儿2～3厘米3.标本的运送和保存♦卡-布（Cary-Blair）运送培养基第二节临床常见标本的细菌学检验（二）微生物学检验1.常见病原菌第二节临床常见标本的细菌学检验2.检验程序第二节临床常见标本的细菌学检验3.检验方法（1）涂片检查♦霍乱弧菌检查：①动力检查：动力及制动试验②染色镜检：革兰染色，发现鱼群状排列的革兰阴性弧菌，可做出初步报告♦酵母样菌检查第二节临床常见标本的细菌学检验葡萄球菌艰难梭菌弯曲菌（1）涂片检查♦葡萄球菌、艰难梭菌、弯曲菌检查♦粪便中优势菌检查：推定主要优势菌并及时报告结果第二节临床常见标本的细菌学检验沙门菌志贺菌（2）分离培养与鉴定♦沙门菌及志贺菌培养粪便或直肠拭子→SS平板、麦康凯平板、GN增菌液→35℃、需氧培养→可疑菌落→生化试验、血清学反应鉴定第二节临床常见标本的细菌学检验五种致病性大肠埃希菌ETEC----肠产毒大肠埃希菌EPEC----肠致病大肠埃希菌EIEC----肠侵袭大肠埃希菌EHEC----肠出血大肠埃希菌EaggEC—肠凝聚性大肠埃希菌（2）分离培养与鉴定♦致病性大肠埃希菌培养脓血或糊状粪便→麦康凯/伊红美蓝/中国蓝平板→35℃、需氧培养→可疑菌落→生化反应、多价血清凝集试验鉴定第二节临床常见标本的细菌学检验♦霍乱弧菌培养米泔水样粪便→碱性蛋白胨水增菌→碱性琼脂平板或TCBS平板→35℃需氧培养→可疑菌落→形态检查、动力及制动试验、血清学试验鉴定♦副溶血性弧菌培养粪便、可疑食物、呕吐物→3.5%NaCl蛋白胨水增菌→SS平板、TCBS平板→35℃需氧培养→可疑菌落→生化试验及耐盐试验鉴定第二节临床常见标本的细菌学检验♦金