园艺植物组织培养第6章

第六章花药和花粉培养花药和花粉培养的研究概况花药和花粉培养的主要内容花药培养方法花粉植株的诱导单倍体植株的二倍体化第一节花药和花粉培养的研究概况花药或花粉培养的目的是为了获得单倍体植株所谓单倍体，指的是具有配子体染色体组成的孢子体。植物体内的单倍体细胞：小孢子大孢子其它自然突变产生的单倍体细胞花药或花粉培养的意义一是获得纯系育种材料和进行单倍体育种,缩短育种年限和提高育种效率;二是用所获得的纯合二倍体材料进行遗传变异规律研究,使园艺植物育种有坚实的遗传理论依据,减少育种的盲目性;三是利用在远缘杂交F1代的花药培养中出现的混倍体和丰富的染色体变异材料进行园艺植物细胞遗传学等基础性研究;四是有利于新抗源的不断发现和野生资源的充分利用。另外,在分子生物技术迅速发展和日趋成熟的今天,花药培养的应用领域不断扩大,其研究意义日益突出。园艺植物的花药培养始于20世纪70年代,随着技术的成熟,研究的深入,目前在许多园艺植物上已获得成功,如柑橘、苹果、李、扁桃、荔枝、枇杷、黄瓜、芦笋、番茄、西瓜、辣椒和花椰菜等。第二节花药培养的方法（1）取材取花粉发育到一定时期的花药进行培养。一般而言，单核后期花药对培养反应较好。因此，花药在接种以前，必须确定花粉的发育时期。2.1培养方法.四分孢子单核中期，细胞质液泡化，核逐渐移向细胞边缘；单核晚期，中央液泡形成，核移到和萌发孔相对的一边花粉第一次有丝分裂中期；.单核早期，核居中，细胞质没有液泡化小孢子发育过程图解双核初期，两核等大；三核期，生殖核分裂成2个精子，营养核开始退化；双核晚期，生殖细胞移到花粉中央双核中期，两核形态上分化为营养核（上）和生殖核（下）三核成熟花粉一般用醋酸洋红压片法进行镜检，以确定花粉的发育时期，并找出花粉发育时期与花蕾或幼穗的大小、颜色等外部特征之间的对应关系。根据这些体征确定花粉的发育时期。但这种相关性不是一成不变的，而会因品种和气候的不同而异，因此，在实验中还必须由每个花蕾取出一个花药，通过镜检确定花粉发育的准确时期（2）预处理目的是提高花粉的诱导率。预处理的方式：低温预处理、离心处理、高温预处理、和预培养等目的：就是从形态上改变其极性分布，从生理生化上改变其细胞生理状态，以改变其分裂方式和发育途径。对于不同的种类、品种和生理状态的花药培养所要求的预处理及其作用也不同。在甜(辣)椒上,低温处理一般采用4～7℃,处理12h～10d。李玉花等以高压静电场处理番茄花药后接种于培养基上,发现高压静电场处理花药可显著提高愈伤组织诱导率,而且静电场处理后可使组培茎丛苗超氧化物歧化酶(SOD)活性升高,丙二醛(MDA)含量降低。（3）消毒花药适宜培养时，花蕾尚未开放，花药在花被或颖片的严密包被之中，本身处于无菌状态，因此，通常只要以70％酒精喷洒或擦拭花器或包被着麦穗的叶鞘表面，即可达到灭菌要求。（4）接种由于花药对离体培养的反应存在“密度效应”，因此每个容器中接种的花药数量不宜太少，以形成一个合理的群体密度。在无菌条件下把雄蕊上的花药轻轻地从花丝上摘下，水平地放在培养基上进行培养，在整个操作过程中不应使花药受到损伤，若受损伤，则应淘汰，因为损伤常常会刺激花药壁形成二倍体愈伤组织。如果所碰到的是花器很小的植物，可借助解剖镜夹取花药，或是只把花被去掉，把花蕾的其余部分连同其中原封未动的雄蕊一起接种在培养基上。在有些情况下，甚至是接种整个花序以得到花粉单倍体。然而这种简单化的方法只适用于这样一些基因型，即其中雄核发育在只含无机盐、维生素和糖的简单培养基上即可进行，而在这种培养基上孢子体组织增殖的机会很少。不过，当必须使用生长素才能诱导花粉粒雄核发育的时候，应当尽可能把孢子体组织去掉。（5）培养方式花药的培养方式主要有3种：一是在琼脂固化培养基表面培养，二是在加人30％Ficoll的液体培养基表面飘浮培养，三是利用固体—液体双层培养基培养，以便既能保持较高的接种密度，培养基又不易失水干涸。（6）培养条件温度花药对培养温度的要求因物种而不同，对于大多数小麦品种来说，在培养的最初6d以30-32℃的较高温度，然后再转入28-30℃下培养，花药出愈率会有明显提高。水稻花药培养的适宜温度从一开始就是27℃。光照对光照的要求在物种间差异更为明显．例如连续光照可显著增加烟草花粉胚的产量，却强烈抑制曼陀罗的花粉胚胎发生。禾谷类植物在花粉愈伤组织诱导期间则以暗培养或散射光培养效果好，强光会抑制小麦花粉愈伤组织的形成。愈伤组织的分化原则上都应在光照下进行，但对光照强度和照光时间的要求则因物种而异。例如水稻花粉愈伤组织在转人分化培养基之初仍不宜照光培养，须待3～5d后再给以每天14h1000～2000lx的光照，以免引起愈伤组织的老化坏死。对小麦花粉植株则不宜给以长日照。（7）花粉植株的诱导烟草花药接种在无激素培养基上1周以后，即有部分花粉粒开始膨大，2周以后细胞开始不断分裂，相继形成球形胚、心形胚和鱼雷形胚等，3周后在花药开裂处即可见到许多淡黄色的胚状体，见光后变绿，并逐渐长成小苗。每个花药中长出的小苗数可从1株到几十株不等，最多者可达180株以上。禾本科植物的花药在培养中通常不能形成胚状体，在这类植物中，花粉植株的诱导往往要分两步进行。第一步，将花药接种在含有2,4-D(1～2mg/L)的诱导培养基上，诱导花粉粒形成单倍体愈伤组织。第二步，当花粉愈伤组织形成后10～15d，其直径已长到1.5～2.0mm时，及时把它们转到分化培养基上诱导植株分化。分化培养基中不含2,4-D，含有NAA和KT各0.5mg/L。在分化培养基上，愈伤组织表面陆续分化出芽和根。注意：在烟草中，花粉植株是经由胚状体产生的，因此几乎都是单倍体。在稻麦等植物中，由于花粉植株是经由愈伤组织产生的，染色体数常有变化，其中既有单倍体，也有二倍体、三倍体以及各种非整倍体等。（8）壮苗和移栽以小麦为例，王培等采用的方法是：将已长出2～3片叶的花粉植株转人含有多效唑3mg/L，NAA和KT各0.5mg/L，LH500mg/L和蔗糖8％的MS养基上，于22～25℃下进行壮苗培养．然后在3～8℃低温弱光条件下越夏，深秋时炼苗移栽。2.2影响雄核发育的因子所谓雄核发育（androgenesis），指的是小孢子沿孢子体途径发育成花粉植株的过程。影响雄核发育的因子很多，除上节提到的以外，还包括以下5个方面：孢子体：在世代交替的生活史中，产生孢子和具二倍体染色体的植物体。配子体：在世代交替的生活史中，产生配子和具单倍体染色体的植物体。世代交替：指的是在生物的生活史中，产生孢子的孢子体世代（无性世代）与产生配子的配子体世代（有性世代）有规律地交替出现的现象。1.基因型基因型是影响花药离体培养反应的关键因子之一。不同基因型植株的花药对培养的反应不同,表现在花药培养力如愈伤组织诱导率、分化率、胚状体诱导率及植株诱导率不同等,有些材料对某些培养基没有反应。陈肖师对17个甜椒品种进行花药培养,胚状体诱导率为0.3%～6.8%不等。Dumas等发现较大果型的灯笼椒花药培养效果较好,产生胚状体花药所占比率为5%～40%。张恩让等对花溪辣椒和青岩辣椒进行花药培养,出胚率分别为1.83%和1.29%。侯喜林在对草莓花药进行离体培养时观察到，女峰的愈伤组织多为绿色或黄绿色，宝交早生的愈伤组织则多呈黄白色或红色(少量为黄绿色)，而丰香的大部分愈伤组织是褐色的。在不同品种的百合中,诱导率从0～19.26%不等。研究表明,花药培养力的大小,是受多基因控制的数量性状,因而随着基因型的差异而有很大变化。2.生理状态在开花末季采集的花药不但形成孢子体的频率很低，而且发生反应的时间也较迟。供体植株的年龄及其所处的生长条件也能影响花药对离体培养的反应，一般来说，幼年植株的花药反应能力较好。在水稻和小麦等禾谷类植物中，大田植株比温室植株、主茎穗比分孽穗花粉愈伤组织的诱导率高。在烟草中，当光照强度相同时，由生长在短日照(8h)条件下的植株上采集的花药，要比在长日照（16h）条件下采集的对培养的反应高出60％。由供体植株生长条件的差异造成的花药对培养反应的不同，可能是内生激素水平变动的结果。王敬驹等（1974）看到，在水稻中若在10℃下用乙烯利预处理植株84h，可增加花药对培养的反应能力。3.花粉发育时期在诱导花粉进行雄核发育的过程中，花粉在接种时所处的发育时期可能比培养基成分更为重要。虽然说，一般情况下单核后期花药对培养反应较好，但不同物种最适的发育时期不同。如在杂配芍药（Paeoniahybrida)中，最适时期是在花粉第一次有丝分裂的当时或稍前稍后。而在颠茄和林生烟草中以双细胞早期最好，很多禾本科植物的花药是在单核早期（大麦）或单核中、晚期（玉米、小麦）反应最好。检查花粉发育时期常用的方法是醋酸洋红染色，但对于DNA含量较低的材料，最好用孚尔根试剂染色。此外，对水稻和玉米等植物而言，I-KI染色效果比醋酸洋红更好。4.药壁因子在花粉胚发育过程中花药壁起着重要的作用。如把一个品种烟草的花粉移植到另一个品种的花药中，前者也能够顺利地发育成胚。花药对同一物种及不同物种离体花粉雄核发育有看护作用。花药浸提液也能刺激花粉胚的形成。组织学研究也证实药壁在花粉胚发育中的作用。在烟草中，只有原来贴靠着花药壁的花粉粒，才能顺利发育成花粉胚。在天仙子中，也只有处在药室外围紧靠绒毡层的花粉能够成胚。这些事实表明，由绒毡层起源的某些重要物质的梯度变化，对于诱导花粉粒发育成胚起着关键的作用。5.培养基（1）基本培养基基本培养基对花药培养的成败影响很大。花药培养研究证实MS，Miller和Nitsch培养基等对花药培养的普遍适用性。另外，又设计了几种新的配方，如适用于稻、麦和玉米的N6培养基，适用于小麦的C17培养基，W14培养基和马铃薯-2培养基，从而提高了这些禾谷类植物花粉形成愈伤组织的频率和愈伤组织分化绿苗的频率。和MS培养基相比，N6，C17和W14的一个共同特点是，大幅度降低了其中氨离子浓度，并调整了其中氨态氮和硝态氮的比率：在N6培养基中，NH4＋离子浓度由MS中的20.62mmol/L降至7.01mmol/L，氨态氮与硝态氮的比值由MS中的0.52降为0.25。（2）碳源在花药培养中，蔗糖一直是最常用的碳源。其他糖类，如麦芽糖、果糖和葡萄糖等做碳源，也可取得了良好的培养效果。例如，据朱至清等在过滤灭菌的条件下，以0.21mol/L葡萄糖取代液体培养基中等摩尔浓度蔗糖，小麦花粉胚的诱导频率可增加2～10倍。当把这些花粉胚转到含有0.21mol/L葡萄糖但无2,4-D的双层分化培养基（过滤灭菌）上以后，其中40%～90％长成了试管苗；而在含有蔗糖的培养基中，只有0％一30％能够成苗。另外，蔗糖在培养基中还起着调节渗透压的重要作用。所用的蔗糖浓度最好能在不妨碍花粉细胞增殖的同时，又能抑制体细胞的增殖。花药培养中采用的蔗糖浓度通常是：甜椒和柑橘等3%，水稻3％～6％，小麦6％～10％，大麦和黑麦草12％，玉米12％～15％。（3）植物激素①雄核发育的途径是直接形成花粉胚。在这些植物中，一般不需要激素，在基本培养基上就可以产生完整的单倍体植株，在有些情况下，甚至连维生素也无必要。例如烟草、曼陀罗等。培养基中的激素成分对于诱导花粉细胞的增殖和发育起着重要作用。由于植物种类不同，花药在离体培养中对激素的要求有2种不同的情况：②花粉粒首先形成愈伤组织，然后，或是在同一培养基中，或是在略加改变的培养基中，由愈伤组织分化出孢子体。在这些植物中，如非茄科物种中，为了诱导花药进行雄核发育，必须单独地或以不同配比在培养基中加入生长调节物质、复杂的营养混合物（如酵母浸出液，水解酪蛋白）和椰子汁等。如在大多数禾本科植物如水稻、小麦、大麦和黑麦的花药培养中，外源生长素，特别是2,4-D(1～3mg/L)，是启动小孢子细胞分裂形成愈伤组织的必要条件。但燕麦和玉米例外，它们的花药在没有外源激素刺激的情况下，即能启动细胞分裂。在水稻和小麦花药培养基中除2,4-D之外还常常添加KT0.5mg/L，其作用或在于增强愈伤组织的胚胎发生能力，或