园艺植物组织培养第12章

12种质贮存•种质保存的主要目的:•最大限度地保持每种物种的遗传多样性。植物的遗传多样性可以表现在物种的水平上，也可以表现在品种和个体的水平上，保存这种多样性的方法有两类：•一类是原生境保存（insituconservation)•一类是异生境保存（exsituconservation)•原生境保存是指在自然条件下对传统的地方品种及其野生物种的保存，保存手段主要是建立自然保护区。在保护区内，野生种自我繁衍，并有可能与地方品种天然杂交，从而形成一个植物育种家难以模拟的进化系统。•异生境保存则是指人工创造的环境条件下对种子或离体的植物细胞、组织和器官的保存，其中种子保存是种质保存的一种传统方式。自1975年Henshaw和Morel首次提出离体保存(conservsfioninvitro)植物种质的策略以来，该项技术受到植物界的高度重视。常用的离体保存方法有组织培养保存法(tissuecultureconservation)和超低温保存法(cryopreservation)。前者适合中短期保存，后者用于长期保存。12.1组织培养保存法利用组织培养技术保存种质资源的理论基础是植物细胞具有全能性的学说。该技术只适合于试验材料、育种材料等的短期保存，一般采用正常生长的途径，也就是将带有腋芽的茎段接种在MS半固体培养基上或液体培养基的滤纸上，然后放在20~25℃的条件下培养，并适时进行继代培养，一般60~90d繁殖一次。按组织培养技术保存种质的原理，可将该保存方法分为常温继代保存法(roomtemperaturesubculturecon—servation)和缓慢生长保存法(slowgrowthconservation)。12.1.1常温继代保存法指在常温条件下，每隔一段时间，将植物细胞或组织进行新一轮的继代培养，以达到保存种质的目的。洋芋无根试管苗在MS+BA8mg/L+NAA0.2mg/L+8g/L琼脂的培养基中，可在常温下保存370d，苗存活率达92％。12.1.2缓慢生长保存法缓慢生长保存，是指通过在培养基中加入化学物质或采用一些物理方法，限制或延缓培养物的生长，使组织或细胞的生长速率降至最小限度，但不死亡，从而达到延长继代培养时间的目的。限制细胞生长速度的途径主要有：改变培养物最适生长温度；调整培养基养分水平；应用渗透性化合物或生长抑制剂；降低培养环境中氧含量等。(1)降低培养温度降低培养温度是植物组织培养物缓慢生长保存最常用的方法。较低温度可以减缓植物的生长速度，在一定温度范围内试管苗的存活率随保存温度的降低而提高，这种方法适合于保存中短期的种质材料。一般用1~9℃低温保存外植体，但热带、亚热带植物在10~25℃之下也能延缓外植体的生长。此法已在众多无性繁殖的园艺植物上应用，如葡萄、草莓、苹果和一些茄属植物等。兰芹英等(2004)在12℃、18℃和24℃条件下对蒙自凤仙花茎尖进行离体保存，结果表明，蒙自凤仙花茎尖最适保存温度为12℃，保存1年后存活率为100％；刘月学等(2004)研究了低温条件下枇杷试管苗离体保存的效果，结果表明，在低温条件下，枇杷试管苗生长缓慢，保存时间较长，在11℃和15℃条件下，品种“解放钟”和“早钟6号”1年后的死亡率分别为20％、25％和15％、20％。(2)调整培养基养分水平植物生长发育状况依赖于外界养分的供给，如果养分供应不足，植物生长缓慢，植株矮小。通过调整培养基的养分水分，可有效限制细胞生长，使培养植物处于最小生长阶段，也称“饥饿法”。Zee和Munekata(1992)在无菌水、完全MS及1／4MS等几种培养基中保存菠萝试管苗，结果显示在无菌水中保存1年后，81％的植株仍保持活力，且比保存在完全的MS培养基中的试管苗活力强，在1／4MS培养基中保持菠萝试管苗效果最好，存活率及再生率都达到100％；铁皮石斛试管苗接种在MS、1/2MS和1／4MS培养基上，在低温下保存80d后发现，MS培养基上的植株生长势最旺，但根少而短，保存1年后，情况发生了变化，MS培养基保存效果最差，存活率只有41.67％，而1／4MS和I/2MS培养基上的存活率分别为91.67％和100％；咖啡分生组织培养的小植株在无蔗糖的l/2MS培养基上，可保存2~2.5年。（3）添加化学物质试验表明，完善和调整培养基中的生长调节剂配比，特别是添加生长抑制物质，利用激素调控技术，不仅能延长培养物在试管中的保存时间，而且能提高试管苗素质和移植成活率。目前，常用的生长抑制物质种类有CCC、B9、PP333、S3307、ABA、TIBA、膦甘酸、甲基丁二酸等。在Ms+IBA0.984μmol·L-1培养基中添加0.216~28.8μmol·L-1浓度的PP333，可使甘薯品种“徐薯18”试管苗在常温下保存1年以上，外源赤霉素能消除甘薯试管苗的多效唑处理后效应，0.289~0.434μmol·L-1l浓度的赤霉素可使保存后的甘薯试管苗生长量恢复到正常水平。在室温(10℃~30℃)条件下，含有0.1ug·g-1ABA的Ms培养基可以有效地减少猕猴桃试管苗继代培养的次数，延长保存时间，随着ABA浓度的增加和保存时间的延长，猕猴桃试管苗丙二醛含量积累，超氧化物歧化酶活性下降；适宜含量的脱落酸也具有延缓葡萄试管苗的生长效果，可用于葡萄试管苗的常温保存，延长转接时间。在培养基中添加一些高渗化合物，如蔗糖、甘露醇、山梨醇等，也是一种常用的缓慢生长保存手段。对蒙自凤仙花茎尖的离体保存研究结果表明，添加1％~5％甘露醇的Ms培养基对茎尖的生长有抑制作用，甘露醇最适浓度为3％，保存1年后存活率为100％；但权银等(1996)发现用高浓度甘露醇取代蔗糖不利于柑桔种质的离体保存，培养物用蔗糖保存1年后的成活率为60～70％。而用2％甘露醇取代蔗糖的处理，其成活率仅为50％。在培养基中同时添加不同的化学物质，也可达到较好的保存效果。铁皮石斛试管苗在l/2MS+0.5mg/LNAA+20mg/L蔗糖+0.5g/L活性炭+7g/L琼脂的培养基上，连续保存l年，存活率达100％；马铃薯茎尖在含有脱落酸和甘露醇或山梨醇的培养基上保存l年后，生长很健壮，转移到MS培养基上生长正常。（4）降低培养环境中氧含量降低培养环境中氧气浓度或培养基中氧分压，抑制外植体的细胞生理活动，减慢培养材料的生长速度，也可以达到种质保存的目的。最简单的方法是在保存材料上加盖一层如液态石油、石蜡等物质，从而使其氧气量降低。Bridge和Staby(1981)首次采用降低培养物周围的氧含量来保存烟草、菊花的小植株，保存42d后取出，其整个生长发育过程中没有发生变化；Dorion(1994)的研究表明，桃的茎尖在低氧(0.20％～0.25％)条件下保存l～2年，不仅全部成活，而且后期再生能力强，但是如果氧的含量降得过低，则其生长速度下降，并导致毒害。因此，有关低氧对离体保存的影响还有待研究。12.2超低温保存法超低温保存是指在一80℃(干冰温度)到-196℃(液氮温度)甚至更低温度下保存生物材料，是目前植物种质资源长期稳定保存的最好方法，它是将低温生物学和微型繁殖(Micropropagation)相结合的一种新型的离体保存技术(或称细胞工程技术)。12.2.1超低温保存方法植物细胞对低温的敏感性因物种不同而有很大变化，因此找不到一种方法可以普遍适用。一般有以下几种方法：（1）慢冷法先把材料以0.5～4℃/min的冷却速度由0℃冷却到-100℃，然后转入液氮。这个方法对于悬浮培养的细胞特别有效。（2）快冷法Seibert(1976)首先证实，在-196℃下保存了2个月的察香石竹离体茎尖能够发育成完整的植株。他的做法是，先把液氮直接倾注到装有材料的小玻璃瓶上，然后再把小玻璃瓶放人一个装满了液氮的容器中。在这个方法中，由-10℃到-70℃之间的冷却速度大于1000℃/min。后来，Seibert和Wetherbee(1977)又报道，对这种材料来说，最好的冷却速度是50℃/min。（3）分步冷冻法这种方法结合了慢冷法和快冷法二者的优点，先把材料分步冷却（(1-5℃/min）到一个适宜的中间温度（-30℃一一50℃)，在这个温度下停留约30min,然后再投人到液氮中快速冷却。已经证明这个方法对于茎尖和芽的冷冻保存最为有效。草毒茎尖经超速冷却后存活率为40％-60％，但若采用分步冷冻法，存活率可提高到60％-80%。此外，分步冷冻法对于悬浮培养的细胞也同样有效。（4）干冻法据报道，凡是在烘箱中或真空下经过干燥脱水的材料，都有显著的抗冻害能力。众所周知，未发芽的干种子能忍受极低的温度，而吸水之后则容易发生冻害。同样，当把豌豆幼苗置于27～29℃的烘箱中，使其含水量由72％~77％下降到27％-40％时，浸人液氮后则可全部免遭冻死。根据Withers(1979)的报道，若是用真空干燥法使细胞脱水，植物器官在经受一196℃冷冻之后存活的情况更好。最适的脱水程度在不同物种和不同组织中可能是不同的。（5）玻璃化法所谓“玻璃化”就是将细胞或组织置于由一定比例的渗透性和非渗透性保护剂组成的玻璃化溶液中，使细胞及其玻璃化溶液在足够快的降温速率下过冷到玻璃化转变温度，而被固化成玻璃态(或非晶态)，并以这种玻璃态在低温下保存。与传统的超低温保存方法相比，玻璃化法操作简单、重演性好，避免了一些种质的冷敏感问题，并且在复杂的组织和器官的超低温保存方面有较好的应用潜力。但是玻璃化溶液对细胞具有一定的毒性，复温后其残余会造成再培养过程中一部分细胞的死亡。12.2.2影响超低温保存的因素影响植物种质超低温保存效果的因素很多，任何一个环节处理不当，均可能导致整个系统的失败。主要因素包括：（1）植物材料的特性植物材料基因型的差异及培养物所处的发育时期和生理状态不同，保存的效果也不同。一般来说，体积小、细胞质稠密、无液泡、薄壁的小型细胞抗冻力强。茎尖生长点、愈伤组织等培养物解冻后，只有具上述特性的细胞才能存活，否则细胞会受到伤害。较大的材料如茎尖、胚或试管苗，由于高度液泡化的细胞易受损伤，冷冻后只有分生细胞能够重新生长。在超低温保存苹果茎尖时，发现材料的生理状态对保存结果的影响甚至比其它因素更重要。（2）冷冻前的预处理预处理是改善材料生理状态的有效方法，总的原则是提高细胞分裂与分化的同步化，减少细胞内自由水的含量，增强植物的抗冻力，在预培养基中补充甘露醇、山梨醇、脯氨酸等渗透剂，对提高细胞的耐冻力有明显的作用。（3）冰冻保护剂冰冻保护剂可以促使结冰早期各阶段进行保护性脱水，降低冰点和水的过饱和点，阻止冰晶生长。冰冻保护剂多是低分子的中性溶质，易溶于水，处理时对细胞没有或很少毒害，进人细胞迅速且便于冲洗。常用的有甘油、二甲基亚砜(DMSO)、糖类、乙二醇、脯氨酸、聚乙二醇等。已经证明DMSO是很有效的冰冻保护剂。使用混合保护剂比单独使用效果更佳，其优越性在于各种成分之间具有协同效应和累加效应(毒性不累加)。马锋旺等以DMSO与山梨醇或葡萄糖混合处理杏愈伤组织，效果明显好于单独使用DMSO；在超低温保存杏原生质体时，获得同样的结果。加入冰冻保护剂应在低温下进行，高温会增加冰冻保护剂的毒害作用。至于采用何种保护剂，必须综合考虑材料的种类和生理状态。12.2.3超低温保存的材料自Nag和Street(1973)首次成功地超低温保存了胡萝卜的悬浮细胞以来，超低温保存技术日趋完善。到目前为止，利用超低温保存的植物材料涉及到细胞(悬浮细胞)、原生质体、愈伤组织、分生组织(茎尖)、芽、花粉、胚或体胚、种子等，大部分已成功地实现了植株再生。（1）种子的超低温保存刘燕等(2001)对l8个科47种花卉种子进行了超低温保存研究，认为花卉种子在自然含水量状态即可存于液氮(LN)中，超低温保存对一些花卉种子萌发表现出促进作用；通过控制芝麻种子的含水量和冷冻速率，Stanwood(1987)成功地保存了芝麻种子，超低温保存后存活率可达80％以上。（2）芽及茎尖分生组织的超低温保存芽的超低温保存是保存无性繁殖植物种质的方便途径。章志宏等(2000)对水