激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)技术简介

.bž激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)是随着光学、视频、计算机等技术的迅速发展而诞生的一种高科技产品。它是在荧光ž显微镜成像基础上加装了激光扫描装置,利用计算机进行图像处理,使用紫外或可见光激发荧光探针,从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像,成为形态学﹑分子细胞生物学﹑神经科学﹑药理学﹑遗传学等领域新一代强有力的研究工具。同时,激光扫描共聚焦显微镜也是活细胞的动态观察、多重免疫荧光标记和离子荧光标记观察的有力工具。不仅可对活的或固定的细胞及组织进行无损伤的“光学切片”;进行单标记或双标记细胞及组织标本的荧光定性定量分析;还可用于活细胞生理信号,离子含量的实时动态分析监测,粘附细胞的分选,细胞激光显微外科和光陷阱技术等。可以无损伤的观察和分析细胞的三维空间结构。-生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物žLSCM是一种高科技显微镜ž荧光显微镜成像为基础，加装了激光扫描装置,计算机进行图像处理,使用紫外或可见光激发荧光探针,得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像。ž无损伤的“光学切片”ž细胞三维立体机构ž实时动态分析监测激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)是随着光学、视频、计算机等技术的迅速发展而诞生的一种高科技产品。生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物ž光学显微镜部分ž激光发射器ž扫描装置ž光检测器ž计算机系统(包括数据采集,处理,转换,应用软件)ž图像输出设备LSCM的基本组成生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物的原理激光光源：激光扫描束经照明针孔形成点光源,普通显微镜采用的自然光或灯光是一种场光源,标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰。而LSCM以激光为光源,激光具有单色性强﹑方向性好﹑高亮度﹑相干性好等优点,可以避免普通显微镜的缺点。一般常用的气体激光器如氩(Ar)﹑氪(Kr)﹑氦(He)﹑氖(Ne)。illuminatingpinhole:照明针孔功能：使激光经过照明针孔后形成点光源，点光源具有光源方向性强、发散小、亮度高、高度的空间和时间相干性以及平面偏振激发等独特的优点。且与detectorpinhole(探测器针孔)及焦平面形成共聚焦装置。分光镜(BeamSplitter)：点光源发出的光经分光镜反射后,通过物镜在样品聚焦。对标本内焦平面上的每一点进行扫描,Focalplane:焦平面功能：激光点光源照射物体在焦平面处聚焦，激发荧光标记的样本发射荧光，形成焦点光斑。该光斑经过物镜和分光镜等一系列装置的处理，分别在照明针孔及探测针孔两处聚焦。共聚焦的含义由此而来。标本上的被照射点所发射的荧光沿同一光路进入物镜,穿过分光镜后在探测针孔处成像,该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。然后经探测针孔后的光电倍增管(PMT)或冷电感耦合器件(cCCD)逐点或逐线接收,将光信号转变为电信号，传输至计算机，迅速在屏幕上形成荧光图像。关键在于：照明针孔与detectorpinhole(探测器针孔)及焦平面形成共聚焦装置。生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物通过调节分光镜（一般是调节反光镜），调节光路，使激发光的焦点恰好通过探测器针孔，随后进入光电倍增管。不在针孔处聚焦的光不能通过。生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物对生物样品的观察的优越性：ž连续扫描三维ž离子荧光标记ž同时多重物质标记在对生物样品的观察中,激光共聚焦显微镜有如下优越性:①对活细胞和组织或细胞切片进行连续扫描,可获得精细的细胞骨架、染色体、细胞器和细胞膜系统的三维图像。②用荧光标记细胞内的离子,可以单标记一种离子也可以多标记几种离子,检测细胞内如pH和钠、钙、镁等离子浓度的比率及动态变化。③用荧光标记探头标记的活细胞或切片标本的活细胞生物物质,通过对膜上、胞浆内多种免疫物质的标记，可以实现在同一张样品上同时进行多重物质标记,同时观察这些物质;④对细胞检测无损伤、精确、准确、可靠、重复性优良;数据图像可及时输出或长期储存。生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物ž激发光和发射光都通过滤片来调节波长，滤片是成对的，调节起来很方便。（左）ž科学研究工作对更高图像分辨率的追求产生了激光扫描共聚焦显微镜。随着免疫荧光技术在生物学研究领域的广泛应用,研究人员注意到,荧光显微照片的分辨率较低,传统的荧光显微镜使用场光源,因标本邻近结构(细胞或亚细胞结构)产生的衍射光和散射光的干扰,使标本中细微结构的成像不够清晰。ž早期的激光扫描共聚焦显微镜采用的是扫描速度较快的狭缝扫描方式,由于其在平行狭缝的光轴面上无共聚焦原理,图像分辨率不高,而被淘汰。随后发展起来的是阶梯式扫描技术,它克服轴外像差,平行移动工作台来逐点扫描标本,提高了图像分辨率,但是对标本制备要求太高,也难于成为成熟的技术。现在的激光扫描共聚焦显微镜采用的是驱动式光束扫描器,具有扫描速度较快和符合共聚焦原理的特点。ž目前激光扫描共聚焦显微镜的光源设计和分光采集技术也有较大的改进。首先是激光器的快速发展,使得现代的激光扫描共聚焦显微镜可以根据研究需要选择不同的激光器。选择激光光源时,一方面要满足研究工作对波长的需求,另一个方面要考虑到激光光源的寿命。其次是近年来对于激光束分光和荧光采集原理也有较大的突破,目前大部分激光扫描共聚焦显微镜仍采用选择性波长滤片轮进行分光和荧光采集(左图),这样的装置完全与传统的荧光显微镜一样使用激发波长滤片和吸收波长滤片来完成对不同的荧光标记进行选择性的成像。ž最新一代激光扫描共聚焦显微镜可以用棱镜狭缝分光的新技术（右图）,配上合适的激光源后,能够摆脱传统的波长滤片组的限制,连续和自由地选择最佳波长),这一特点对于现在和未来开发出的各种新的荧光标记物(特别是各种荧光蛋白和荧光染料)和研究动植物的自发荧光物质有很高的价值,从某种意义上,这一技术革新已使新一代激光扫描共聚焦显微镜超脱了传统的荧光显微镜系统。与此同时用于激光扫描共聚焦显微镜的物镜也做了较大的改进,可以与高速扫描功能相匹配。生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物常用于生物细胞或组织内的分子原位鉴定和定量,细胞及亚细胞结构形态学观察;以及活体细胞或组织功能的动态监测.在生命科学领域的分子水平,细胞及组织水平的研究中得到广泛应用.生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物ž在细胞原位用特异探针标记出核酸,蛋白质,多肽,酶,激素,磷脂,多糖,受体等分子ž并用激光扫描共聚焦显微镜成像,从而实现上述大分子的定位,定性及定量检测生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物ž(一)在细胞原位检测核酸ž(二)原位检测蛋白质,抗体及其他分子ž(三)检测细胞凋亡ž(四)细胞器观察及测定ž(五)检测细胞融合ž(六)观察细胞骨架ž(七)检测细胞间缝隙连接通讯ž(八)检测细胞内脂肪生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物ž检测核酸的荧光探针ž1碘化丙啶(PI)---不能进入完整的细胞膜ž2Hoechst33342,Hoechst33258和DAPIž3AO(吖啶橙)生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物ž常用的荧光探针:ž1荧光染料FITC:蓝光激发,发出明亮绿色荧光ž2罗丹明:比FITC光稳定性好,在生理条件下对PH变化不敏感,荧光强度受细胞自发荧光的干扰较小生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物绿色荧光蛋白（greenfluorescentproteinGFP）蓝色荧光GFP绿色荧光Ca2+肠腔素Aequoren+n*可对活细胞中的蛋白质进行准确定位及动态观察生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物ž通常用的方法:ž1细胞核形态观察ž2脱氧核苷酸未端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)ž3Annexin-V试剂盒是检测凋亡细胞膜损伤的新方法生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物ž不同实验目的,标记细胞器的方法也不同.1线粒体MitochondriaRodamin123MitotrackerGreenFMMitotrackerOrangeCMTMRosMitotrackerOrange2溶酶体Lysosome中性红AOLysoTrackerGreenDND-26/Blue/Red3内质网EndoplasmicReticulumDiOC64高尔基体GolgiapparatusNBDC6-ceramie生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物ž根据不同细胞的特性,将每一种细胞特有的物质用不同的荧光控针标记;ž融合操作后,确认不同的荧光信号是否发生共定位于同一细胞;ž如在同一细胞中同时检测到上述不同的荧光信号,则说明已经发生了细胞融合.生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物ž骨架(微丝,微管和中等纤维)直标:一抗+荧光探针(如:肌动蛋白actin)间标:二抗+荧光探针(如:微管蛋白tublin)生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物肌动蛋白(Actin)标记肌动蛋白是微丝的基本成分毒伞素(鬼笔环肽)---与多聚体肌动蛋白微丝专一性结合起来且亲和作用强烈.生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo.com生物秀-专心做生物微管蛋白(Tubulin)标记生物秀-专心做生物生物秀论坛-学术交流、资源共享与互助社区bbs.bbioo