流式细胞仪的构造、工作原理及数据分析

流式细胞仪的构造、工作原理及数据分析东北师范大学生物基础实验教学中心巴雪青•流式细胞术（flowcytometery,FCM）是20世纪70年代发展起来的一种可以快速、准确、客观，可同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性，并加以定量的技术，并且可以对特定群体加以分选。研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量。•流式细胞仪是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机以及细胞荧光化学技术为一体的新型高科技仪器。流式细胞仪的特点单个细胞或微粒分析同时多参数分析速度快：10000个细胞(微粒)/秒统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况分选感兴趣的细胞或微粒•其结构一般分为5部分：流动室及液流驱动系统；激光光源及光束形成系统；光学系统；信号检测、存储、显示分析系统；细胞分选系统。（一）流动室与液流驱动系统•流动室是仪器核心部件，被测样品在此与激光相交。流动室由石英玻璃钢制成，并在石英玻璃中央开一个孔径为430μm×180μm的长方形孔，供细胞单个流过，检测区在该孔的中心，这种流动室的光学特性良好，流速较慢，因而细胞受照时间长，可收集的细胞信号光通量大，配上广角收集透镜，可获得很高的检测灵敏度和测量精度。•流动室内充满了鞘液，鞘液的作用是将样品流环包，鞘液流是一种稳定的液体流动，鞘液以匀速运动流过流动室，在整个系统运行中流速是不变的，样品流在鞘液的环包下形成流体力学聚焦，使样品流不会脱离液流的轴线方向，并且保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。流式细胞仪的流动室和液流驱动系统•(二)激光光源与光束形成系统•目前台式机FCM，大多采用氩离子气体激光器。激光(laser)是—种相干光源，它能提供单波长、高强度及稳定性高的光照，是细胞微弱荧光快速分析的理想光源。由于细胞快速流动，每个细胞经过光照区的时间仅为1μs左右，每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间和激发光的强度有关，因此细胞需要足够的光照强度。•激光光束在达到流动室前，先经过透镜将其聚焦，形成几何尺寸约为22μm×66μm，即短轴稍大于细胞直径的光斑。这种椭圆形光斑激光能量分布属正态分布，为保证样品中细胞受到的光照强度一致，须将样本流与激光束正交，且相交于激光能量分布峰值处。•(三)光学系统流式细胞仪的光学系统•FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片、小孔组成，•主要光学原件是滤光片，主要分成3类：长通滤片(long-passfilter，LP)、短通滤片(short-passfiltr，SP)及带通滤片(band-passfilter，BP)。•它们分别将不同波长的荧光信号送到不同的电子探测器LONG(700nm)550LongPass(650LP)650ShortPass(600SP)SHORT(500nm)PassThroughFilters600/100BandPass(600/100)Transmitted650nm550nm550-650nm(600?0)WavelengthsBlocked650nm550nm550nm&650nmShortPassLongPassBandPassLONG(700nm)550LongPass(650LP)650ShortPass(600SP)SHORT(500nm)DichroicFiltersTransmitted650nm550nmDiflected90?650nm550nm•(四)信号检测与分析系统1．散射光信号：•散射光分为前向角散射(forwardscatter，FSC)和侧向角散射(sidescatter,SSC)，散射光不依赖任何细胞样品的制备技术(如染色)，因此被称为细胞的物理参数或称固有参数。以上两种信号都是来自激光的原光束，其波长与激光的波长相同。•前向角散射光（FSC,ForwardScatter）细胞相对大小及其表面积•侧向角散射（SSC,SideScatter）•细胞粒度及细胞内相对复杂性•(1)前向角散射：前向角散射与被测细胞的大小有关，确切地说，它与细胞直径的平方值密切相关。通常在FCM应用中，选取FSC作阈值，来排除样品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒，以避免对被测细胞的干扰。•(2)侧向角散射：侧向角散射是指与激光束正交90°方向的散射光信号，侧向散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信息。2．荧光信号激光的作用原理(1)荧光信号的线性测量与对数测量•当携带荧光素的细胞与激光正交时，受激发发出荧光，经过滤光片分离不同波长的光信号分别到达不同的光电倍增管(PMT)，PMT将光信号转换成电信号。电信号输入到放大器放大，放大器分两类：线性放大和对数放大。•细胞DNA含量、RNA含量、总蛋白质含量等的测量一般选用线性放大测量。•在细胞膜表面抗原等的检测时，细胞膜表面抗原的分布有时要相差几十倍，甚至几万倍。如用线性放大器，将无法在一张图上清晰地将细胞阳性群、阴性群同时显示出来通常使用对数放大器，如果原来输出是1，当输入增大到原来的10倍时，输出为2；当输入增大到原来的100倍时，输出为3等。(2)荧光信号的面积和宽度•所谓荧光信号的面积是采用对荧光光通量进行积分测量，一般对DNA含量测量时，均采用面积(FL2－A)来计算。这是因为荧光脉冲的面积比荧光脉冲的高度更能准确反映DNA的含量。•荧光信号的宽度(如FL2－W)常用来区分双联体细胞(3)光谱重叠的校正•使用荧光补偿电路•合理设置荧光信号的补偿值。•(五)FCM测量数据的的存储、显示和分析流式细胞仪数据分析数据存储:LISTMODE数据显示:直方图(Histogram)二维点图(DotPlot)等高线图(ContourPlot)密度图(Density)三维图（3DPlot）等FSCSSCFL1FL2Event13060638840Event210016024585Event3300650160720•单参数直方图每一个细胞单参数的测量数据可整理成分布统计，以分布直方图(distributionhistogram)来显示。在图中，横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度的值，其单位是道数，横坐标可以是线性的，也可以是对数的，纵坐标一般是细胞数DNA含量直方图和抗原表达直方图•双参数数据的显示双参数数据的显示是用于表达来自同一细胞两个参数与细胞数量的关系，常用的表达方法有二维点图(dotplot)、等高线图(contourplot)、二维密度图(densityplot)。在二维图中，x坐标为某细胞一个参数的数值，而Y坐标为该细胞另一参数的数值。从双参数图形中可以将各细胞亚群区分开，同时可获得细胞相关的重要信息。外周全血细胞散射光双参数点图（红细胞溶解后）双色荧光标记细胞散点图等高图和密度图分析数据分析三维图分析流式细胞仪的科研应用树突细胞研究干细胞研究癌症病人的多药耐药性细胞动力学功能研究环境微生物分析流式细胞术与分子生物学研究脑栓塞病人血小板活化检测•ACD61-SSC设分析门•B阴性对照•C治疗前–PAC-I27.74%–CD62P15.86%•D溶栓后–PAC-I9.13%–CD62P4.12%细胞凋亡——Caspases-3谢谢