中药指纹图谱

中药指纹图谱李文娟中药指纹图谱简介1中药指纹图谱研究方法2中药指纹图谱研究内容3中药指纹图谱的建立与评价4中药指纹图谱示例51.中药指纹图谱简介1.1指纹图谱的起源与发展中药指纹图谱鉴别借用了法医学的指纹鉴定的概念，指纹图谱技术应用于植物药质量控制的历史沿革：20世纪70年代——色谱技术的发展，人们大量采用薄层色谱（TLC）方法，将植物中化学成分展载于由各种担体铺成的薄层板上。根据薄层板上的斑点的位置、斑点大小、斑点、颜色、斑点数目的多少进行定性鉴别，这种薄层鉴别方法具备了指纹图谱的特征。20世纪70-80年代——出现薄层扫描仪，日本和我国部分学者用薄层扫描仪得到复方成药扫描图作为色谱指纹图尝试应用于药材及成药分析。20世纪80-90年代——高效液相技术得到发展，同时植物药中化学成分的分离鉴定、活性成分的不断阐明，高效液相广泛应用于定性、定量分析。西方普遍采用高效液相色谱法对植物药中已知及未知组分进行控制，并形成相应的规范。目前高效液相色谱法已成为当前研究指纹图谱的主要手段。中药化学信息：植物药（包括来源于植物的中药材）的提取物（包括中药的汤药）与化学合成药最根本的区别是，它（即使是单味药材）是多种化学成分的混合体。这种多种化学成分的综合体构成了“中药化学信息”。由于中药的疗效由多种成分的协同作用或“相克作用”，中药中的化学信息有一定的模糊性。只有部分化学信息（包括已知的活性成分、已知的非活性成分、一部分未知成分）可表征于指纹图谱中。1.2中药指纹图谱的定义中药指纹图谱，即中药身份证，主要指中药化学指纹图谱，实际上是一种保证中药质量的措施，是指对某种中药材或中成药等运用现代分离分析科学的手段，得到能够标示该中药的色谱或光谱的图谱，最终用来对中药质量评价的科学性方式。特点：1.通过指纹图谱的特征性，能有效鉴别样品的真伪或产地。2.通过指纹图谱主要特征峰的面积或比例的制定，能有效控制产品的质量，确保产品质量的相对一致。1.3指纹图谱在中药评价中的应用指纹图谱在评价中药质量中的作用主要可以概括为观察指纹图谱的整体特征以鉴别生产前药材的真伪;指纹图谱可以区分植物药材的不同部位;可以考察商品药材及成药的质量;从标准指纹图谱可追踪制剂中某些化学成分的变化;可以检测原料与成品之间,成品的批间质量的稳定性。由次生代谢产物组成的中药提取物的色谱指纹图谱不仅具备个体的绝对的惟一性，更强调的是物种特征的惟一性与同种植物中的相似性。1.4中药指纹图谱的分类•中药指纹图谱按应用对象分类，根据中药指纹图谱可用于中药制剂研究、生产过程的各个阶段，可分为中药材(原料药材)指纹图谱、中药原料药(包括饮片、配伍颗粒)指纹图谱和中药制剂指纹图谱。如分得更细，还可包括用于工艺生产过程中间产物的指纹图谱。两种中药原料药指纹图谱应区别对待。对中药饮片指纹图谱的要求基本和中药材指纹图谱相同。对中药配伍颗粒(包括标准提取物)指纹图谱应要求高一点。•中药指纹图谱按测定手段可分为中药化学(成分)指纹图谱和中药生物指纹图谱。中药化学(成分)指纹图谱系指采用光谱、色谱和其他分析方法建立的用以表征中药化学成分的特征的指纹图谱。光谱最常用的是红外光谱(IR)。色谱最常用的是薄层色谱(TLC)、气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)和毛细管电泳(CE)。其他方法包括波谱和联用技术。中药化学指纹图谱首推色谱方法和联用技术。TLC法简便易行，但提供信息量有限，很难反映几十种、上百种化学成分组成的复杂体系。GC适用于挥发性化学成分。HPLC适用于非挥发性成分，中药中大部分化学成分均可用HPLC法得出良好的指纹图谱。CE适用于大部分化学成分，特别是生物大分子——肽和蛋白的分离，但其重现性有待提高。1.5中药指纹图谱建立的意义与原则•中药指纹图谱建立的是全面反映中药内在化学成分的种类与数量，进而反映中药的质量。现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确，采用中药指纹图谱的方式，将有效地表征中药质量。指纹图谱已为国际社会所认可，有利于中药及产品进入国际市场。•中药指纹图谱的建立，应以系统的化学成分和药理学研究为依托，应体现系统性、特征性、重现性三个基本原则。•实现中药指纹图谱的三原则，保证其标准化，做到统一规范，这样才可以使中药指纹图谱得以推广应用。•“系统性”是指指纹图谱所反映的化学成分应包括中药有效部位所含大部分成妥的种类，或指标成分的全部。•“特征性”是指指纹图谱中反映的化学成分信息（具体表现为保留时间或位移值）是具有高度选择性的，这些信息的综合结果，将能特征地区分中药的真伪与优劣，成为中药自身的“化学条码”。•“重现性”是指所建立的指纹图谱，在规定的方法与条件下，不同的操作者和不同的实验室应能作出相同的指纹图谱，其误差应在允许的范例内，这样才可以保证指纹图谱的使用具有通用性和实用性，也是作为标准方法所必备的特征之一。•实现指纹图谱的重现性，除在样品制备方法、分析过程、结果处理待环节规范操作外，还应建立相应的评价机制，对指纹图谱进行客观评价，并公布标准指纹图谱。2.中药指纹图谱研究方法学2.1常用指纹图谱研究的方法与技术运用包括光谱、波谱、色谱、核磁共振、X射线衍射及各种技术的联用等现代分析技术，将中药化学信息通过色谱图（液相色谱图、气相色谱图或薄层色谱图）等方式进行表达；并且对指纹图谱经过计算、分析、比较、评价等过程，以技术参数、指纹特征等加以说明。研究对象的不同，指纹图谱研究的方法与技术也不同，并都随着现代科技技术的发展而发展，中药指纹图谱研究所采用的方法大致分为：色谱法：薄层色谱法（TLC）、液相色谱法（LC）、气相色谱法（GC）、高效毛细管电泳法（CE）；光谱法：紫外光谱法（UV）、红外光谱法（IR）、近红外光谱法（NIR）；核磁共振法（NMR）等。色谱联用技术：将色谱良好的分离能力与光谱或波谱特有的结构鉴别能力相结合并借助近年来发展起来的化学计量学技术和己有的光谱波谱标准库，是完全可能对大部分中药的化学成分进行定性和相对定量分析的。目前色谱光谱联用技术如:GC-MS、HPLC-MS已经在中药指纹指纹图谱研究领域内获得了一定的成功。薄层色谱(TLC)•特点：由于操作简单，展开剂组成灵活多样，色谱后衍生方便，可以提供色彩斑澜的彩色图像，直观易辨，在中药鉴别中应用频率最高。采用合格材料和标准操作，可得到高质量的色谱图像，于同板同时比较鉴别多个样品，配合数码成像和数据处理，还可瞬间形成轮廓图谱，并给出各峰积分值，加大信息量，从而提高综合分析能力，比较适合原料药材指纹图像分析。•应用：TLC作为主要的鉴别方法被多国植物药典收载。《中国药典))2000年版一部采用薄层色谱法作鉴别的品种已达602种，占所收载的中药材的60％以上。近年来TLC指纹图谱的研究也较多，谢培山等对人参、西洋参、三七，在优化的规范操作条件下得到的薄层色谱荧光彩色图像，在同一板上形象地比较了3个样品的异同。颜玉贞等对黄连TLC指纹图谱研究发，其荧光及紫外扫描轮廓图可用以鉴别黄连。李彩君等对高良姜中黄酮类成分进行了薄层色谱指纹图谱研究，可有效地鉴别高良姜。薄层色谱可同时鉴别多个样品。•缺点：存在着效能低、灵敏度差的缺点。而且其层析系统是一开放体系。要想得到稳定、重现性好的图谱，必须严格控制实验条件。其提供的信息有限对于成分复杂的中药及其复方制剂难以用TLC指纹图谱来鉴别及评价质量。气相色谱(GC)•特点：以气体为流动相，对于含挥发性成分中药的鉴别具有一定优势。由于裂解气相色谱具有操作简便、样品无须化学前处理、提供信息量大等优点而格外引人注目。该方法将样品故人裂解器内，在一定的条件下将样品加热使其瞬间裂解，生成可挥发性的小分子物质，立即被载气带人气相色谱系统的分析柱上，分离后得到具有指纹性质的裂解气相色谱图。如果将气相色谱与质谱、傅立叶变换红外光谱联用，则不但可以知道不同中药中挥发性成分的差别，而且可以对这些成分进行鉴定。•应用：气相色谱适用于药物中挥发性成分的分析，实际应用中常与质谱联用。凌大奎等用规范化的色谱分离油成分的GC的保留指数(GCRI)，利用GC-MS和GC-傅利叶变换红外光谱(FTIR)对各主要成分进行了定性鉴别。钱浩泉等用GC-MS联用的方法，对高良姜及其近缘植物进行鉴别，发现它们的指纹特征明显不同，各自特有的色谱图谱具有特征代表性。高效液相色谱(HPLC)•特点：具有分离效能高、分析速度快、灵敏度高、方法重现性好、选择性高、适用的样品类型广泛等特点。与薄层色谱相比，它是封闭系统色谱，受外界影响小，色谱稳定性、重现性好，其分离、鉴别能力远远高于薄层色谱。HPLC所分析的中药中，有相当部分为次生代谢产物，而这些产物的组成和含量不仅和药材本身的种属有关，同时还与植物后天所处的地域环境、生长条件、采摘时间和炮制方法有很大的关系。对于中成药来说，与产品的加工过程也有很大的联系。不同的加工过程与方法都将对所得的指纹图谱有相当影响，表现在峰高、峰面积、保留时间以及峰数量上的变化等。因此，HPLC不仅可以用来对生药的真伪、优劣进行鉴定，同时还可以对中药的加工过程进行监测，可以有效地分析鉴定经过不同的炮制、加工的中成药。•应用：已经普遍应用于中药材及制剂的分析检测，特别是三维高效液相色谱法近年来发展很快，非常适合构建中药指纹图谱。在中药指纹图谱中首推高效液相色谱指纹图谱。粟晓黎等运用HPLC指纹图谱法对中药鬼臼的毒性成分进行分析，指出利用鬼臼的HPLC指纹图谱可以鉴别鬼臼(桃儿七)、龙胆、威灵仙。高增平等以人参皂苷，为对照，建立了三七药材的HPLC的指纹图谱。翟为民等建立了人参、西洋参及三七的HPLC指纹图谱用以鉴别区分三者。高速逆流色谱指纹图谱(HSCCC)•特点：HSCCC利用动态液-液分配原理分离样品，其分离度和重现性与HPLC类似，但样品前处理简单。具体地说它是一种基于液-液多级逆流萃取建立的色谱体系，以轻巧的聚四氟乙烯螺旋管作分离柱，在行星式运动中连续地完成整个分配、传递、分离过程；无固相载体，避免了待分离样品与固相载体表面发生化学反应而变成不可逆吸附；分辨率高，可分离纯品；可采用正向或反向的连续洗脱、步级洗脱、梯度洗脱等方式；可采用多种多样的溶剂系统实现物质的对流分配；能在一个流程中分离复杂样品中极性差异极大的各个组分，特别是能有效地分离强极性的组分；仪器及试剂成本明显低于高效液相色谱，•应用：适用于制备高纯度、高附加值的化合物。沈平孃研究了HSCCC在中草药分离、分析方面的应用。超临界流体色谱法(SFC)•特点：以超临界流体作流动相，它通过控制压力调节流动相的密度实现对溶解度的调节，从而使不同物质分别进行溶解与分离。超临界流体溶解能力强，流动性好，传质速率快，融合了HPLC和GC的优点而部分地避免了它们的缺点。SFC比GC应用范围更广，比HPLC定量效果更好，分离的时间更短，样品的前处理更简单，更易与大型分析仪如质谱仪、傅里叶变换红外光谱仪和核磁共振谱仪等联用。•应用：SFC适用范围很广，理论上，能够用HPLC分离和测定的化合物，都可以用SFC来分离和测定，某些用HPLC不能分离的物质用SFC也能得到较好的效果。高效毛细管电泳技术(HPCE)•特点：是近10多年来发展很快的一种高效分离分析技术，以高压电场为驱动，毛细管为分离通道，依据样品中各组分淌度和分配行为上的差异而实现分离。具有灵敏度高、柱效高、分析速度快、所需样品量少、溶剂消耗少和抗污染能力强等优点。•应用：不仅适用于小分子酸碱、盐及中性分子和生物大分子如核酸、多肽、蛋白质等的分析，在中药有效成分分析方面也显示出一定优势。中国药典2000年版已将其定为法定定性定量方法。孙毓庆等以毛细管电泳指纹图谱研究了冬虫夏草与蛹虫草、人工蛹虫革、伪品及次品的区别。紫外光谱(UV)和红外光谱(IR)•UV——特征的差异，在—定程度上反映了中药化学成分的差异。某些情况下，伪品虽可在外观上以假乱真，但其化学成分的组成和含量与正品必有差异，这种差异在紫外光谱上必有所反映。如果中药亲缘相近而紫外光谱不易区别，可采用多阶导数光谱法提高分辨率。•IR