pull-down-实验方法

PullDown实验流程1.混合两种预测相互作用的蛋白。（Protein-A-GST&Protein-B-HIS，下面实验用GST树脂IP，用WesternBlot检测HIS；反之亦然。如果是纯化后的蛋白，需要进行偷袭或者使用超滤离心管为蛋白更换溶液，之后才能继续PullDown。）2.加入1mLBindingBuffer。BindingBuffer：50mMTris.HCl（pH7.50.）100mMNaCl0.25%Triton-X10035mMβ-Me（巯基乙醇）3.将混合蛋白在4℃条件下旋转结合2-4h。4.加入20-30μLGST-BindTMResin结合2-4h。5.4℃，150-200g离心2min，吸弃上清（小心！不要吸弃底部沉淀）。第一次弃去的上清样品记为Washing-Protein-A/Protein-B，用于SDS-PAGE电泳时的对照。6.加入1mLBindingBuffer，4℃条件下旋转混匀5-10min，4℃，150-200g离心2min，吸弃上清。7.重复步骤6，用1mLBindingBuffer清洗5-6次。8.最后一次清洗后留有20-30μL液体，加入适量的LoadingBuffer，95℃金属浴5-10min，150-200g离心5min，样品记为上样跑SDS-PAGE电泳。电泳样品顺序：Marker，Protein-A-GST，Protein-B-HIS，Washing-Protein-A/Protein-B，PullDown-Protein-A/Protein-B此次电泳的目的，一是初步检测两个蛋白是否互作，二是可以为后面正式实验所需蛋白量提供参考。用于正式检测两个蛋白是否互作电泳顺序如下：（input，蛋白量为后两者的1/10）Marker，Protein-B-HIS，GST+Protein-B-HIS，Protein-A-GST+Protein-B-HISMarker，Protein-A-GST，HIS+Protein-A-GST，Protein-B-HIS+Protein-B-GST9.转PVDF膜，350mA恒流，2h左右。（PVDF膜用之前，用甲醇泡2min）10.做WesternBlot过程：预杂交1h以上；杂交一抗1h以上；洗膜三次，每次10min；杂交二抗1h以上；洗膜三次，每次10min。11.显影：用1mL发光液A+1mL发光液B浸润PVDF膜，然后固定，显影液显影1min（时间可以适当调整），水洗，定影1min。12.扫描杂交胶片结果。