环氧树脂包埋HE染色试验步骤2016.4.20-张丽

环氧树脂包埋-半薄切片-HE染色1，环氧树脂包埋1.1取材1.1.1快：组织从活体取下后应在最短时间内(争取在1分钟内)投入2.5%戊二醛固定液。1.1.2小：一般不超过1mm×1mm×1mm。也可将组织修成1mm×1mm×2mm大小长条形。因为固定剂的渗透能力较弱，组织块如果太大会影响细胞超微结构的保存。1.1.3轻：机械损伤要小，解剖器械应锋利，操作宜轻，避免牵拉、挫伤与挤压。1.1.3冷：所用的固定液、操作工具要预先冷藏，操作环境温度最好在低温(0℃～4℃)下进行，以降低酶的活性，防止细胞自溶。1.1.4准：取材部位要准确，即各组实验动物必须取材在同一脏器的同一位置，这样才能有较可信的比较。1.2固定2.5%戊二醛固定2小时以上，pH7.2～7.4。固定完毕，用缓冲液漂洗30分钟后进行脱水。1.3脱水70%丙酮15分钟，80%丙酮15分钟，90%丙酮15分钟，100%丙酮20分钟(分二次进行)1.4浸透和包埋将组织块包埋在多孔橡胶包埋模板的环氧树脂中浸透，然后置烤箱烘干，在45℃(12小时)、60℃(36小时或更长)烤箱内加温，即可聚合硬化，形成包埋块。1.5注意事项：(1)所有试剂要防潮，最好存放在干燥器中；(2)所用器皿应烘干；(3)配包埋剂时，每加入一种试剂要搅拌均匀；(4)包埋时动作要轻巧，防止产生气泡；(5)皮肤尽量不要接触包埋剂，以免引起皮炎；(6)盛放过包埋剂的容器要及时用丙酮清洗干净；（7）操作过程最好在通风柜中进行。2，半薄切片制备按常规环氧树脂包埋法将组织制成包埋块,在半薄切片机上切成0.5-1μm的半薄切片，切片于组织切片于65℃烤箱中过夜。3，试剂配制配制饱和氢氧化钠无水乙醇溶液,静置一周,使溶液呈黄褐色。取上述溶液与二甲苯按3:1(V/V)混合成工作液(临用前配制)。4，脱环氧树脂将半薄切片置工作液中5-10min，捞出经无水乙醇洗后镜下观察以确认树脂脱净；弃掉工作液，无水乙醇清洗5minx3次,此时脱树脂完成。5，HE染色(苏木精—伊红染色法(hematoxylin-eosinstaining)，简称HE染色法，苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。)5.1过程为：经95%、80%、70%梯度乙醇每次5min漂洗；三蒸水5minx2次，Harris苏木素5min(观察细胞核为蓝色)，水洗(流水冲)10min，0.5%盐酸酒精分色3~5s(镜下观察)，水洗蓝化15~30s(注意换水)，蒸馏水过洗1-2s，水溶性0.5%伊红液5min，蒸馏水过洗1-2s，经70%、80%、90%、95%、100%、100%梯度乙醇每次5min漂洗，二甲苯+乙醇(1：1)5min，二甲苯15minx2次，Histomount中性树胶封片剂封片。5.2Histomount封片剂是合成封片剂中最常用的一种，为保存和运输切片标本提供永久的密封保护。为中性pH，对紫外线稳定，能够多年保持透明度和亮度不变。折射率与盖玻片载玻片相匹配，减小光照时的色差。有效对抗大多数清洁剂，可作为传统玻璃盖玻片载玻片的永久封片介质。5.3HE染色注意事项：5.3.1染色时调节pH值很重要。如果组织块在福尔马林中固定时间长，组织酸化而影响细胞核着色。因此，要在自来水中冲洗时间长一些或在饱和碳酸锂水溶液中处理10-30min，这样可以使细胞核着色较深。染伊红时胞浆着色不佳，可在伊红溶液中滴加1-2滴冰醋酸。5.3.2切片染苏木精后，分色这一步是关键，应在显微镜下控制进行，一般以细胞核染色清楚（晰）而细胞质基本无色为佳。如果过分延长分色时间将导致染色太浅，应重新染色后再行分色。5.3.3切片经酒精脱水后，入二甲苯时可出现白色不透明状态，此为脱水不彻底，应将切片退回无水酒精，更换酒精、二甲苯，以求彻底脱水与透明。5.3.4在染色过程中不要让切片干燥，以免切片收缩、变形，影响神经元形态。5.3.5切片从二甲苯取出或进入二甲苯前，切片周边均应擦干净或吸干多余水分。5.3.6最后封固时，要用中性树脂，防止日后褪色，盖片要选大于组织块的面积，如漏出一部分不久将会褪色，所用树脂浓度要适当，树脂封固时不能有气泡。