ELISA实验步骤

实验步骤（以处理小鼠血清样品为例）：通用版血清处理：将收集的小鼠血液样品室温静置40min~1h后（不要超过1h），放在冰上待处理（不要超过4h），或者及时离心处理。静置待血液析出血清后，3000rpm（1000g），4℃，10min离心，离心后应呈现上层为无色或淡黄色透明血清，下层为凝集的红色血团。若上层血清呈现淡粉色或红色，则表示该血液样本溶血，血清颜色越深则表示溶血程度越高。吸取血清时若不小心吸到下层红色部分，则沿壁缓慢打回原EP管，过度机械损伤会造成溶血。用1.5mlEP管，可按吸出的血清量加入等体积的0.1M的盐酸，即样品中HCl的终浓度为0.05M。若血清量很大，则最好按实验需要分装成小管，避免血清反复冻融，然后冻存于-80℃备用。若做Elisa实验，则取出所需要量的血清，待融化后再1:1加入等体积的0.05M的HCl，既将血清稀释了4倍，HCl的终浓度仍然为0.05M，混匀后低速离心备用。1.取出整盒ELISAkit（保存于4℃冰箱）放在37℃培养箱预热0.5h至常温，将摇床温度调至31℃，转速为150转/min。2.用已灭菌的MQH2O，稀释10XHRPwashbuffer至1X。3.取出所需数量的wells，放在96孔底板上，板上可用数字标记好行列，避免出错，准备纸巾，铺8层左右，比底板略大即可。1XHRPwashbuffer300ul/well，沿着孔壁缓慢加入，以免破坏杯底的抗体。加完后用手轻微震荡5s，迅速翻转，将液体甩入水池，再在纸巾上拍打，不能太轻，也不能太用力，杯底朝上，尽量将杯内所有液体倒干净，如上重复洗3遍，保证每孔湿润。此后每次加入液体均沿着杯壁缓慢加入，移液枪枪头不可接触杯内液体。加入不同样品时要及时更换移液枪枪头，加入相同液体时，可从不同方向沿杯壁加入，避免污染原管液体。4.在空白和标准品的wells里，加入20ulMatrixsolution。空白对照设置1孔即可，标准品为5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625ng/ml六个wells。5.在标准品的wells里加入10ulAssayBuffer,在空白和样品的wells中，加入30ulAssayBuffer。6.在标准品的wells里加入20ul标准品，在样品的wells中，加入20ul处理好的样品。7.加入DetectionAntibody50ul/well，若孔内有气泡，可用注射器的针头轻轻戳破，但注意不要碰到杯内液体，避免不同孔内污染。盖上贴纸，用手轻轻震荡5s，略混匀，注意不要将液体弹到贴纸上。放入平板摇床，31℃(温度过低会降低反应速率)150转/min，反应2h8.轻轻揭掉贴纸，防止杯内液体弹出粘在贴纸上，甩掉wells内的液体，并在纸巾上拍打，用1Xwashbuffer洗3次，300ul每次。最后一次要倒净杯内液体（否则背景很高）。9.Enzymesolution100ul/well,轻轻震荡混匀。盖上贴纸，放在平板摇床上，31℃150转/min，反应30min。10.轻轻移除贴纸，甩掉wells内的液体，用1Xwashbuffer洗6次，300ul每次，洗完后用酒精喷湿的纸巾将wells的底部擦干净透明，不要留纸屑和水渍，以免影响后来酶标仪的读值。加入第6遍的washbutter后，先不倒掉，保证孔内湿润的情况下，到公共实验室开启酶标仪，确保其可用。再回实验室倒掉孔内液体，并拍打干净。11.加入Substratesolution100ul/well，轻轻震荡混匀，盖上贴纸，平放入不透明袋子中，注意平稳不让液体黏在贴纸上，放入在平板摇床上，31℃150转/min，反应15min（孔内液体会变蓝，标准品蓝色随浓度升高而逐渐升高）。（如果颜色过淡，可适当延长时间）。12.加入Stopsolution100ul/well，明显可见到孔内液体由蓝色变为黄色。加完后轻轻震荡混匀，使其充分反应。在5min内用酶标仪分别在450nm及590nm波长下读吸光度（程序为事先设定好的）。13.空白值为空白well的450读数减去590读数。其余wells的值为450读值减去590读值，再减去空白值。做出标准曲线后，再用所得公式计算样品中ghrelin的含量。