药学中的生物技术和方法2015-1-基因工程和干细胞技术

IV-GeneandstemcelltechnologyGenetechnology•GeneClone•GeneAnalysisandIdentification•GeneTransformation•GeneEditingGenecloneGenelibraryGenomicDNAmRNADNAfragmentscDNARestrictionenzymeDNAlibcDNAlibligationligationReversetranscriptionvectorToolsforgeneclone•Restrictionendonuclease•DNApolymeraseandDNAligase•Vector:plasmidorl-phage•Hostcells•PCRandRT-PCRPCR(PolymeraseChainReaction)cDNA合成与RT-PCRMultipleAnnealingandLoopingBasedAmplificationCycles(MALBAC)forSinglecellgenomicsequencing高通量DNA测序DNAanalysisI:DNAhybridizationprobeDNAlibpositiveclonesScreeningthegenomiclibraryoftrypanosomacruziDNAanalysisII:实时荧光定量PCR技术（RealTimePCR）DNA测序:基因分析的终极技术第一代第二代第三代第一代：Sanger法（DNA双脱氧链终止法---末端距离分析法）第二代：合成测序法-高通量测序（碱基时序法）左起：谢晓亮、乔杰、闫丽盈、汤富酬2014年9月19日，世界首例经MALBAC基因组扩增高通量测序进行单基因遗传病筛查的试管婴儿在北京大学第三医院诞生，这标志着我国胚胎植入前遗传诊断技术已处于世界领先水平。2代半：Single-moleculereal-time(SMRT)sequencingtechnology单分子实时测序技术第三代：单分子DNA读序（纳米孔技术）蛋白质分析技术和蛋白组学Samplereserve•蛋白序列•物种•转录后修饰•蛋白质相互作用基因导入系统•感受态细胞：直接转染载基因质粒•细胞模型：脂质体、电转染和病毒载体•整体动物：病毒载体•病毒载体：–插入整合型：逆转录病毒载体。但其存在潜在的安全性风险；–非整合型：慢病毒载体、腺病毒载体脂质体转染法慢病毒转染法植物细胞的基因转染基因编辑方法•已克隆的基因：PCR法•细胞内基因：•1：PCR法•2：RNAi基因沉默法•3：sRNA指导定位编辑法PCR基因点突变技术RNAi基因沉默法实用中的shRNA基因沉默技术CRISPR(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)/Cas9基因编辑技术报告基因技术I：荧光蛋白标签钱永健，下村修，MartinChalfie报告基因技术II：信号转导检测Biotech.forStemcells•干细胞具有自我更新和多能分化能力，主要包括胚胎干细胞(ES)、间充质干细胞(MS)和诱导多能干细胞(iPS)等•iPS由于其在疾病模型及再生医学中的应用能力与胚胎干细胞类似，且不存在伦理问题，逐渐成为这一领域的新星。干细胞的诱导分化山中伸弥（ShinyaYamanaka），毕业于大阪市立大学。2006年首次利用4个转录因子Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4将小鼠成纤维细胞重编程为胚胎干细胞样的多能干细胞，并验证了其具有与胚胎干细胞类似的多元分化能力和自我更新能力，从而建立小鼠诱导多能干细胞系。2012年，山中伸弥获得诺贝尔生理或医学奖。诱导多能干细胞iPSiPS：方法和问题•Yamanaka四因子的经典iPS细胞诱导体系：向体细胞转入4个转录因子Oct4/Tet1、Sox2、c-Myc和Klf4•化学小分子iPS细胞诱导体系:丙戊酸、Parnate、Repsox、FSK、DZNep和CHIR-99021–其中CHIR、FSK和Repsox能够激活Sall4、Sox2的表达，而DZNep能激活Oct4的表达•iPS瓶颈问题–重编程效率低和培育周期长。四因子体系的诱导效率不足1%，化学小分子体系仅~0.05%–免疫原性问题–基因不稳定性问题。iPS中存在着染色体的异常和更多的小突变–致瘤性问题干细胞技术和药物开发-I：干细胞用于药物筛选和临床前评价干细胞技术和药物开发-II：病人干细胞干细胞和药物开发-III：肿瘤干细胞（CSC/TSC）•肿瘤干细胞可通过细胞间通讯诱导正常干细胞向肿瘤干细胞转化肿瘤干细胞（CSC/TSC）的特征•四个重要特征：1、自我更新的能力；2、多分化潜能；3、高增值能力；4、耐药性–多药耐药（multidrugresistance，MDR）是导致肿瘤治疗失败的主要原因之一。肿瘤干细胞一般处于静止期，高表达ABC外排转运蛋白，使化疗药物在肿瘤干细胞上无效。•白血病干细胞是•表面抗原鉴定：CD133+和CD44+–Warning：乳腺癌干细胞表型[CK8+,14+,18+;Vimentin+，EGFR+]与乳腺干细胞表型相同；脑肿瘤干细胞表型[CD133+、musashi-1+、Sox2+、melk+、PSP+、Bmi-1+和nestin+]与神经干细胞完全一致。•功能学方法鉴定：–细胞微球形成能力–多向分化能力–体内成瘤实验肿瘤干细胞靶向治疗的思路思考题•什么是基因克隆？基因库有哪些种？分别有哪些特点？•PCR的原理和应用有哪些？•单细胞基因组扩增的技术有哪些？原理和特点是什么？•什么是核酸杂交分析？如何用核酸杂交分析筛选目标基因？•Real-timePCR的原理和技术要点是什么？•第一代基因测序技术的原理和技术要点是什么？•什么是合成测序法？其如何实现高通量测序的？•谢晓亮和乔杰做了什么胚胎植入前遗传诊断技术的工作的？意义是什么？•单分子基因测序的方法都有哪些？纳米孔测序技术的原理和应用是什么？•蛋白质组学的技术路线和方法是什么？如何与基因组学研究相呼应？•基因转染的方法有哪些？技术要点是什么？有哪些应用的风险？•RNAi基因沉默技术的原理和技术要点是什么？目前的方法有哪些？•如何用PCR技术制备定点突变的基因？•什么是CRISPR/Cas9基因编辑法？其原理和技术要点是什么？有哪些应用？•什么是报告基因？绿色荧光蛋白有多少种颜色？在基因展示上有哪些应用？•如何用报告基因技术研究细胞的信号转导？•什么是干细胞和肿瘤干细胞？两者又哪些相同和不同的地方？•什么是iPS？有哪些诱导iPS的方法？目前的技术瓶颈是什么？•干细胞如何用于药物筛选和临床前评价？•肿瘤干细胞靶向治疗的原理是什么？有哪些应用？