卢坤平 脯氨酰异构酶pin1 一种在磷酸化信号和疾病中起关键作用的新的异构酶

1TheprolylisomerasePIN1:apivotalnewtwistinphosphorylationsignallinganddiseases.NatRevMolCellBiol.2007Nov;8(11):904-16.脯氨酰异构酶pin1：一种在磷酸化信号和疾病中起关键作用的新的异构酶卢坤平andXiaoZhenZhou赵德豹、延兴学译，杨达云校译摘要蛋白质磷酸化作用通过改变蛋白质构象控制着许多细胞过程。脯氨酰顺反异构酶Pin1已经被确定在磷酸化信号通路中起调节者的作用，它能够将一系列蛋白质中的特定磷酸化基序在两种完全不同的构象之间进行催化转换。Pin1调节多种细胞过程，包括细胞生长信号反应、细胞周期进展、细胞应急反应、神经功能和免疫反应。与Pin1的多种生理学作用相一致，它与许多疾病的发生相关联，包括癌症、阿尔兹海默病和哮喘。因此，Pin1可能会成为一种新的治疗靶点。引言蛋白质的磷酸化作用是一个关键的细胞信号机制，它可以引起蛋白质构象的改变。例如：许多酪氨酸残基和一些丝氨酸/苏氨酸残基的磷酸化起着信号的作用，这种信号可以用来招募蛋白质到信号网络或者使一些酶与相对应的底物靠近。同样地，一些酶的磷酸化作用，如糖原磷酸化酶和某些蛋白激酶的磷酸化作用会诱导其催化结构域构象的改变，这种构象的改变可使难以接近催化位点的底物接近酶的催化位点。然而，多少种其它磷酸化事件真正地调控细胞信号以及它们在磷酸化后是否能被进一步调控，目前在很大程度上这还未知。在细胞中，丝/苏-脯氨酰基序中的丝氨酸/苏氨酸是一个主要的磷酸化调节位点。负责这种起磷酸化作用的酶属于以脯氨酸为导向的蛋白激酶超家族，这个家族包括细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶（CDKs）、细胞外信号调节蛋白激酶（ERKs）、应急激活蛋白激酶/c-JunN端蛋白激酶（SAPKs/JNKs），p38激酶、糖原合成酶激酶3（GSK3）、马球样激酶（PLKs）。这些激酶在多种细胞过程中起着关键性作用，例如在细胞生长调节、应激反应和神经元存活，以及人类的一些疾病如癌症和阿尔兹海默病(AD)。脯氨酸的独特立体化学性能意味着它可2以具有两种完全不同的构象状态【Box1】。然而，关于Pro经常被发现位于磷酸化的Ser/Thr之后的这个事实的重要意义在很长时间里并没有被人们所认识。直到这种独特并保守的肽基脯氨酰顺/反异构酶Pin1（与非有丝分裂A1相互作用的蛋白）的发现，才使人们在理解脯氨酸导向的磷酸化基序的构象重要性上取得突破性进展。肽基脯氨酰顺/反异构酶（PPIase）是一种进化保守的酶，它能够催化肽基-脯氨酰基多肽键发生顺/反异构化作用【Box1】。虽然pin1属于PPIase家族中的细小蛋白亚家族，但它是PPIase家族中唯一一个特异性识别磷酸化的脯氨酸导向的丝氨酸/苏氨酸（pSer/Thr-Pro）肽序列的PPIase。Pin1作为一种磷酸化位点特异的PPIase的鉴定，使人们提出了一种新的信号机制假设，即pin1通过对底物磷酸化作用之后的构象进行催化调节，进而控制蛋白质的功能。后续的研究显示，pin1催化的蛋白质构象调节对许多关键蛋白的功能产生深远影响，而这些蛋白质在细胞生长调节、基因毒性和其它应激反应、免疫应答、胚胎细胞的发育、神经分化和存活中起作用。Pin1已经成为一种新的分子钟，它通过对某个细胞过程的各个步骤中的多个靶标进行调节，来协同控制细胞反应或过程的幅度和持续时间。重要的是，pin1自身受到多个层面的紧密调控，而它的异常表达在日益增多的病症中起重要作用，包括癌症、阿尔兹海默症、衰老、哮喘和微生物感染。最近的研究也显示，不依赖于磷酸化作用的脯氨酰基的异构化具有分子钟的功能，它调节许多生理和病理过程，包括信号传导、离子通道控制、基因表达和噬菌体感染。在本文，我们对pin1催化的后磷酸化调节的分子和结构基础进行综述，讨论这种调节机制在人体生理学和病理学方面的重要意义，并探索这种机制在新的疾病诊断和治疗干预中的潜力。3Box1pin1催化的磷酸化的丝氨酸/苏氨酸-脯氨酸基序的构象转换由于脯氨酸在多肽骨架中含有一个五元环，这使得它是氨基酸中唯一有能力在蛋白质骨架扭转角中采用顺式或反式构象的氨基酸（见图）。脯氨酸周围的局部环境可以影响顺式和反式构象异构化状态的相对自由能，从而导致不同的蛋白质中顺式构象与反式构象的比例发生巨大变化。虽然在天然蛋白折叠的背景下，大多数蛋白质的结构需要脯氨酸采用二者中的一种异构体，但最近的结构研究表明，在某些特定脯氨酸残基中，两种构象状态同时存在。由于存在相对大的能障，没有酶催化的异构化作用是一个相当缓慢的过程，但是通过肽基脯氨酰顺/反异构酶（PPIase）的催化可以极大的加快异构化过程。这些酶在蛋白质的折叠中发挥作用，例如在已经研究的很深的亲环素蛋白（Cyps）和FK506结合蛋白（FKBPs）的折叠中发挥作用，Cyps和FKBPs分别是免疫抑制性药物环孢素A和FK506的细胞内靶标，FKBPs还是免疫抑制剂和抗癌剂雷帕霉素的靶标。然而，最终结果表明这些药物的作用不涉及对PPIase活性的抑制，而是涉及对钙调磷酸酶的酶活性和TOR（雷帕霉素的靶标）激酶的活性的抑制。此外，在出芽酵母中，8种Cyps和4种FKBPs无论是从单个还是从整体上对菌体的活力都是非必要的。因此，PPIase曾被认为在细胞中只是执行不重要的功能，怀疑把它们作为治疗靶标是否有价值。磷酸化位点特异的脯氨酸异构酶pin1的发现为证实脯4氨酸顺反异构作用在细胞中的重要性提供了新的认识。最近的研究发现依赖或者不依赖磷酸化的脯氨酸异构作用在一些生物学和病理学进程中可以起到分子钟的功能。作用于脯氨酸导向的磷酸化蛋白的独特开关脯氨酸的独特性在于它能够采用顺式或反式的构象存在；而脯氨酸的非酶催化的异构化本身是非常慢的过程，而这种构象的改变可以通过PPIase进行催化（Box1）。虽然PPIase能够控制顺式/反式异构化的转换动力学一种固有的构象转换开关，但是在Pin1被发现之前，PPIase被认为只是执行一些不重要的细胞作用，这种酶活性作为一种重要的调节机制在人体生理学和病理学中的意义也不清楚。Pin1特定异构化pSer/Thr-Pro基序，这种作用非常重要，因为脯氨酸导向的蛋白激酶和磷酸酶具有构象特异性，它们只在反式构象时起作用。此外，磷酸化作用对丝氨酸/苏氨酸-脯氨酸键本身已经很慢的异构化进行了极大的降低，并且使磷酸肽键抵抗传统PPIase的催化作用。脯氨酸导向的磷酸化作用还诱导蛋白局部结构改变，进而使它可以被进一步修饰。到目前为止，Pin1和其同系物是已知的唯一能够对脯氨酸导向的磷酸化基序进行高效异构的酶。这一结论已经在出芽酵母中得到证实，pin1的同族物Ess1是总共13种PPIase基因中的唯一一个必需基因。Pin1在一些生物体如曲霉属真菌、念珠菌中也是必不可少，但是在其它生物体如裂殖酵母、小鼠中并不是不可缺少的，尽管pin1基因敲除的动物会出现许多有趣的表型。一个可能的解释是，pin1与其它PPIase有一些重叠的功能。然而，pin1只对一小簇脯氨酸导向的磷酸化位点进行异构化，因此可能存在其它磷酸化特异的PPIase。的确，在植物中至少含有三种pin1的同族物，黑腹果蝇中至少有两种，并且在pin1缺陷的细胞中检测到其它对特定磷酸化位点异构化的PPIase（K.P.L.,未发表的观察）。此外，一种mRNA编码的与pin1高度相似的基因Pin1L已经在小鼠中鉴定到，尽管它对应的蛋白及其功能至今还没有被鉴定。Pin1作为催化开关的动力学过程Pin1包含有两个结构区域，N-末端的WW区域（根据N末端两个保守的色氨酸残基命名）和C-末端的PPIase区域【图.1a】。早期在体外及体内对pin1结构功能的分析已经揭示了PIN1独特的底物特异性，即它通过两个结构域的相互作用一种双校对机制，使其特异地定位pSer/Thr-Pro基序。Pin1蛋白中的WW域只结合到pSer/Thr-Pro基序上，而这种基序在5pin1的底物中通常是关键的调节磷酸化的位点【图.1b】。在不同的亚细胞结构中，pin1的WW域结合到目标底物蛋白上，而具有PPIase酶活性的区域催化特定的pSer/Thr-Pro基序，从而通过调节蛋白的构象来控制蛋白的功能【图.1c】。图1pin1特异地定位在磷酸化的丝氨酸/苏氨酸-脯氨酸基序的结构基础a)人类pin1蛋白（与NIMA（非有丝分裂A）-1相互作用的蛋白质）的结构。Pin1包括一个氨基末端的WW域（介导结合于特定的磷酸化丝氨酸/苏氨酸-脯氨酰基序）和一个羧基末端的肽基脯氨酸顺反异构酶（PPIase）结构域（催化底物中特定磷酸化丝氨酸/苏氨酸-脯氨酰基序发生异构化作用）。b)WW域中包括羧基末端结构域（CTD）多肽的Pin1蛋白复合体的x衍射结构图。WW域中的丝氨酸16、精氨酸17、和酪氨酸23负责结合磷酸化的丝氨酸5（多肽中第5个残基），而酪氨酸23和色氨酸34的芳香环形成一个芳香夹钳，它容纳脯氨酸6（第六个残基）环状原子。c)PPIase域中包含磷酸化的丝氨酸-脯氨酸二肽的pin1复合体的x衍射结构图。在典型的磷酸化酶pin1这类PPIase中一组保守的催化残基从桶装结构向外延伸构成脯氨酸和其肽键的结合口袋，被结合的多肽进行顺/反异构化作用。侧链的赖氨酸63、精氨酸68和精氨酸69的残基形成一个吞没底物中磷酸化丝氨酸的集群。位于pin1型和细小蛋白型脯氨酰顺反异构酶第63位的赖氨酸是保守性的氨基酸，它参与基础催化。相反，68位和69位的精氨酸只在pin1型的PPIase中是保守的，它们负责pin1型的脯氨酰顺反异构酶对磷酸化位点的特异性识别。6后续的多方面结构分析已经证实了这个基本原则，并且揭示了pin1是如何动态地结合它的底物并且调控它们的构象。pin1作用淀粉样前体蛋白（APP）的核磁共振(NMR)分析已经揭示了细胞内的APP在两种完全不同的结构之间的动态调控。淀粉样前体蛋白（APP）中含有一个Thr668-Pro基序，在发生磷酸化作用之前它是反式构象。顺式构象的APP只在磷酸化作用引起的局部结构限制之后才会出现，其中约10％的这种磷酸化基序是以顺式构象存在【图.2】。pin1与顺式和反式构象的pThr668-Pro基序的结合，与典型的没有催化剂的反应（反应以分钟计量）相比，pin1使这种异构化加速1000多倍（反应以毫秒计量），而且它对顺式向反式异构的速率比反向异构的速率快近10倍。因此，如果细胞中这两种构象中的任何一种的总量突然减少，pin1将迅速重建顺式/反式构象的平衡。Pin1在与磷酸化多肽结合形成复合物的结构研究证实这是种磷酸化依赖的相互作用。目前还尚不清楚为什么pin1仅与某些蛋白的特定pSer/Thr-Pro基序结合，这可能是由于组合性主要的（或其他）结构决定因子所致。对pin1结合的特异性至关重要的多肽序列位于pin1羧基末端可变环的WW区域，这个可变环的结构会根据配体结合发生改变，表明序列特异性的动态结构对pin1与特异性的底物结合很重要。目前还不清楚WW域和PPIase酶结构域是如何协作对pin1的底物起作用。核磁共振（NMR）方面的研究已经表明WW域和PPIase酶结构域是松散的连接模块，但是它们的移动能够被不同的磷酸化多肽进行不同的调节。此外，在体外实验中，WW域可以根据多肽底物是在一个还是多个磷酸化位点发生磷酸化来提高或者降低pin1异构酶的活性，尽管这些研究发现的生物学意义还不清楚。有关许多pin1底物只含有一个pin1磷酸化靶点的发现表明，当pin1通过WW域定向的结合于底物时，该PPIase酶结构域将会对同样的pSer/Thr-Pro基序起作用，从而加速它的异构化。或者，当一个pin1的底物含多个磷酸化位点或者是一种多蛋白复合体时，这种WW域和PPIase酶结构域可能会对这种相同蛋白（或不同蛋白）的不同pSer/Thr-Pro基序产生作用。这些重要问题的解决还有待进一步研究。7图2pin1催化的脯氨酸异构化作用调控的一系列靶标的活