发酵法生产L-天冬酰胺酶

发酵法生产L－天冬酰胺酶学生模拟组建运营一个L－天冬酰胺酶生产企业，撰写计划书(在理论教学期间完成)。市场部：L－天冬酰胺酶的结构、功能、用途，L－天冬酰胺酶市场状况与销售预测，竞争对手状况与分析。技术部：确定L－天冬酰胺酶生产的工艺流程及工艺参数，编制生产操作规程，确定生产车间的布局。品控部：制定L－天冬酰胺酶的质量标准，生产取样分析操作规程，质量检测标准和操作规程。总经理：协调监督各部工作，最后拿出完整的计划书。L-天冬酰酶生产工艺一、结构与性质由四个相同亚基组成，有222个对称轴，每个亚基含326个氨基酸残基。用于儿童急性淋巴细胞白血病、单细胞白血病、淋巴肉瘤、胰腺癌等。机理：降低人体内天冬酰胺和谷氨酰胺浓度，正常细胞可自我合成，癌细胞不具备这种能力，从而受到抑制。性状：白色粉末，微吸湿，溶于水，不溶于有机溶剂。二、生产工艺1工艺路线[精制]聚乙二醇不同pH值处理甘氨酸60℃，30min醋酸pH=4.2~4.4[压滤、风干]丙酮[发酵]玉米浆[提取]硼酸缓冲液pH=8.3，37℃[种子培养]玉米浆37℃,24h[菌种培养]肉汤培养基大肠杆菌肉汤菌种37℃,4~8h种子菌种37℃,6~8h发酵液干菌体提取液粗酶酶溶液无热原酶液无菌分装门冬酰胺酶冻干制剂2工艺过程及控制要点(1)菌种培养采取大肠杆菌AS1-375，普通牛肉培养基，接种后于37℃培养24h。(2)种子培养16％玉米浆，接种量1％～1.5％，37℃通气搅拌培养4～8h。(3)发酵罐培养玉米浆培养基，接种量8％，37℃通气搅拌培养6～8h，离心分离发酵液，得菌体，加2倍量丙酮搅拌，压滤，滤饼过筛，自然风干成菌体干粉。(4)提取、沉淀、热处理每千克菌体干粉加入0.Olmol／LpH8.0的硼酸缓冲液lOL37℃保温搅拌1.5h，降温到30℃以后，用5mol／L醋酸调节pH4.2～4.4进行压滤，滤液中加入0.2倍体积的丙酮，放置3～4h，过滤，收集沉淀，自然风干，即得干粗酶。取粗制酶，加入0.3％甘氨酸溶液，调节pH8.8，搅拌1.5h，离心，收集上清液，加热到60℃30min进行热处理。离心弃去沉淀，上清液加2倍体积的丙酮，析出沉淀，离心，收集酶沉淀，用0.01mol／L，pH8.0磷酸缓冲液溶解，再离心弃去不溶物，得上清酶溶液。(5)精制、冻干上述酶溶液调节pH8.8，离心弃去沉淀，清液再调pH7.7加入50％聚乙二醇，使浓度达到16％。在2～5℃放置4～5天，离心得沉淀。用蒸馏水溶解，加4倍量的丙酮，沉淀，同法反复1次，沉淀用pH6.4，0.05mol／L磷酸缓冲液溶解，50％聚乙二醇反复处理1次，即得无热原的L—天门冬酰胺酶。溶于0.5mol／L磷酸缓冲液，在无菌条件下用6号垂熔漏斗过滤，分装，冷冻干燥制得注射用L—天门冬酰胺酶成品，每支1万或2万单位。3检测方法取lml0.04mol／L的L—天门冬酰胺，0.5mol／LpH8.4的硼酸缓冲液，0.5ml细胞悬浮液或酶液，于37℃水浴中保温15min后加0.5ml15％三氯醋酸，以终止反应沉淀细胞或酶蛋白，离心取上清液1ml。加2ml奈斯勒试剂和7ml蒸馏水15min后，于500nm波长处比色测定产生的氨。