EdU-细胞增殖检测试剂盒(成像检测)使用说明

北京索莱宝科技有限公司第1页共5页EdU细胞增殖检测试剂盒（成像检测）使用说明货号：CA1170规格：100T保存：室温运输，4°C储存，勿冻存，荧光试剂请避光保存，可稳定储存一年。产品说明EdU（5-Ethynyl-2’-deoxyuridine）是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶（T）渗入正在复制的DNA分子中，通过基于EdU与Apollo荧光染料的特异性反应快速检测细胞DNA复制活性，适用于细胞增殖、细胞分化、生长与发育、DNA修复、病毒复制、细胞标记示踪等方面的研究，尤其适合进行siRNA、miRNA、小分子化合物及其他药物的筛选实验。与BrdU检测方法相比，EdU检测方法更快速、更灵敏、更准确。EdU与T非常相似，而EdU染料只有BrdU抗体的1/500，在细胞内很容易扩散，无需DNA变性（酸解、热解、酶解等），可有效避免样品损伤，而且无需抗原抗体反应，能在细胞和组织水平更准确地反映DNA复制活性。贴壁细胞宜采用荧光检测方式，适用于荧光显微镜、共聚焦显微镜、高内涵筛选仪检测，亦可进行爬片检测。悬浮细胞可用涂片方式荧光检测，亦可采用流式细胞仪分析，但流式细胞仪需要具备相应荧光通道。Apollo567激发波长550nm发射波长565nm实验准备：1.1XPBS(pH7.2~7.6)2.渗透剂(含0.5%TritonX-100的PBS)3.甘氨酸溶液(2mg/mL)（去离子水配置）试剂浓度规格EdU溶液(试剂A)1000X20μLApollo反应缓冲液(试剂B)20X500μLApollo催化剂溶液(试剂C)100X100μLApollo荧光染料溶液(试剂D)300X30μLApollo缓冲添加剂(试剂E)粉末100mgHoechst33342(试剂F)100X150μL北京索莱宝科技有限公司第2页共5页4.细胞固定液(含4%多聚甲醛的PBS)5.96/24/12/6孔培养板或培养皿等注意：请使用一次性手套，废液请妥善处理。操作步骤：荧光显微镜检测方法（以96孔板，A549贴壁细胞为例）1、EdU标记1.1用细胞培养基按1000：1的比例稀释EdU溶液(试剂A)，制备适量50μMEdU培养基；1）EdU浓度与孵育时间相关，短时间孵育（2h）宜采用高浓度（10-50μM），长时间孵育（24h）宜采用低浓度（1-10μM）;2）如果需配置10μMEdU培养基，需调整为5000：1稀释比例；3）配置好的培养基的保存时间取决于培养基的性质。1.2每孔加入100μL50μMEdU培养基孵育2小时，弃培养基；1）最佳孵育时间与细胞周期相关（附表），大多数肿瘤细胞系均可采用2小时孵育时间；2）EdU培养基用量以没过细胞为宜，但需要保证EdU孵育时间内的营养物质持续供给；1.3PBS清洗细胞1-2次，每次5分钟。注：清洗目的是将未渗入DNA的EdU洗脱，清洗方式依据不同的细胞类型而定，贴壁不牢的细胞请降低清洗强度。2、细胞固定化2.1每孔加入50μL细胞固定液(即含4%多聚甲醛的PBS)室温孵育30分钟，弃固定液；1）低浓度的多聚甲醛有利于细胞结构的保持，2）可采用其他方式进行细胞固定。2.2每孔加入50μL2mg/mL甘氨酸，脱色摇床孵育5分钟后，弃甘氨酸溶液；注：目的是中和多聚甲醛，保证染色反应体系，当采用其他方式进行细胞固定时可酌情省略此步骤；2.3每孔加入100μLPBS，脱色摇床清洗5分钟，弃PBS；北京索莱宝科技有限公司第3页共5页2.4每孔加入100μL渗透剂(0.5%TritonX-100的PBS)脱色摇床孵育10分钟；PBS清洗1次，5分钟。注：当实验需要进行其他抗体染色时，或由于某些细胞类型对染料的吸附性较高，可能需要增强细胞膜通透性。3、Apollo染色3.1每孔加入100μL的1XApollo染色反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30分钟后，弃染色反应液；1）染色液用量与细胞量相关，以覆盖细胞为宜；2）孵育时间可以进行适当调整，调整范围为10-30分钟。3.2加入100μL渗透剂(0.5%TritonX-100的PBS)脱色摇床清洗2-3次，每次10分钟，弃渗透剂；3.3（可选）每孔每次加入100μL甲醇清洗1-2次，每次5分钟；PBS清洗1次，每次5分钟。注：由于某些细胞对染料的吸附性较高，需采用加强方式洗脱以降低染料背景。4、DNA染色4.1用去离子水按100：1的比例稀释试剂F，制备适量1XHoechst33342反应液，避光保存；4.2每孔加入100μL1XHoechst33342反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30分钟后，弃染色反应液；4.3每孔每次加入100μLPBS清洗1-3次；4.4客户可选择进行其他染色步骤，否则每孔加入100μLPBS保存待用。建议染色完成后立即进行观测；如果条件限制，请避光4℃湿润保存待测，但不应超过3天。注：调试仪器时，请将曝光时间调整为30ms左右，尽量不要1s实验参考表1EdU孵育时间设定参考细胞系人胚胎细胞酵母细胞人成纤维细胞人宫颈癌细胞人胚肾细胞系人神经细胞细胞周期-30min-3h-18h-21h～25h-5d孵育时间5min20min2h2h2h1d注：1）EdU孵育时间取决于细胞周期，一般为细胞周期的1/10至1/5，但大多数细胞系均可采用2h孵育时间；北京索莱宝科技有限公司第4页共5页2）考虑到细胞培养基、温度、湿度、光线等其他因素的影响，细胞周期会有所变化。表2EdU培养基及染色反应液的使用量参考96孔板*48孔板24孔板12孔板6孔板5.5cm小皿EdU培养基100μL200μL300μL500μL1mL2mL染色反应液100μL200μL300μL500μL1mL2mL表3Apollo染色反应液的配置参考（现用现配）配制顺序Apollo染色反应液500μL*1mL5mL10mL1去离子水469μL938μL4.69mL9.38mL2Apollo反应缓冲液(试剂B)25μL50μL250μL500μL3Apollo催化剂溶液(试剂C)5μL10μL50μL100μL4Apollo荧光染料溶液(试剂D)1.5μL3μL15μL30μL5Apollo缓冲添加剂(试剂E)5mg9mg44mg88mg注：1）*表示通常配制的Apollo反应液的体积；2）按顺序配制适量1XApollo染色反应液，以免破坏正常的反应体系(现用现配，30分钟用完)；3）试剂E为白色粉末，较难准确称量，称量误差范围可稍微放宽，但丌应超过±20%。且其较易氧化，使用后请旋紧管盖，如试剂出现棕黄色，则需报废或更换。FAQ1.什么样的信号才是真正的EdU阳性信号？1）Apollo染色信号与核酸染色信号（Hoechst33342或DAPI等核染信号）完全重合，或者与核重合的信号明显强于胞浆上的信号（染料附着等）2）一般部分细胞上的信号呈现上述特征，而不是全部细胞。2.整个细胞都有EdU信号，或背景信号很强。1）染色后洗涤不充分，可尝试加强洗涤解决。2）染色过程中干片，导致染料粘附严重。北京索莱宝科技有限公司第5页共5页3）多聚甲醛固定时间过长而未使用甘氨酸中和。4）没有阳性信号曝光过度导致背景严重。3.没有阳性信号。1）EdU处理时间太短导致没有阳性信号。体外细胞实验一般EdU处理时间宜为细胞周期长度的1/5-1/10，阳性率约为20%-30%，体内实验需根据目的组织细胞的增值速度进行调整，若细胞增值速度慢，需要采用长时间的EdU处理时间，2）对于阴性结果，可设置阳性对照（常见肿瘤细胞株如HelaEdU处理2小时或者EdU处理6小时以上的小鼠小肠上皮组织）以确认染色过程无误，对于目的样品，可使用较长的EdU处理时间以尽量先检测出信号，再根据具体信号比例进行EdU处理时间的调整。4.细胞中表达GFP,Apollo染色后检测不到GFP的荧光信号。Apollo染料会造成GFP的失活，故Apollo染色后无法直接检测GFP，建议可以使用GFP抗体进行复染医间接检测GFP。