沙门菌H抗原的xTAG法鉴定解析

·应用技术·沙门菌H抗原的xTAG法鉴定郑之北　郑伟　濮小英　文艳苹　潘劲草　汪皓秋310021浙江省杭州市疾病预防控制中心通信作者:郑之北,Email:[e-mail],电话:[phone]DOI:10.3760/cma.j.issn.0254-5101.2016.12.011【摘要】　目的　利用LuminexxTAG技术,建立能高通量鉴别沙门菌H抗原的xTAG悬浮芯片法,用于沙门菌的血清型别鉴定。方法　以沙门菌编码H抗原的fliC和fljB基因为目标基因,选取其保守片段设计上游通用引物,选取可变片段设计下游特异性引物;合成时上游引物的5′端用生物素标记,下游引物的5′端连接特定的TAG序列;标本经多重PCR扩增并标记生物素和TAG序列后,与含anti-TAG序列的编码磁珠混合液杂交分型,通过生物素与链霉亲和素-藻红蛋白的反应报告结果。利用建立的xTAG悬浮芯片法鉴定145株沙门菌日常分离株的H抗原,并与传统的血清凝集试验比较。结果　31种沙门菌H抗原经多重PCR扩增后,与xTAG磁珠杂交后可鉴别分型,各H抗原间无交叉反应,且重复性良好,与大肠埃希菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌及志贺菌DNA等亦无交叉反应。对145株沙门菌进行H抗原鉴定,与传统的血清凝集试验比较,其敏感度为95.1%,特异度为100%。结论　利用xTAG悬浮芯片法鉴定沙门菌H抗原,特异准确,可在4~5h内完成90多株常见血清型沙门菌的H抗原鉴定。【关键词】　沙门菌;H抗原;xTAG技术基金项目:浙江省杭州市科技局医疗卫生及重点专科专病科研攻关专项(20140633B24)IdentificationofSalmonellaHantigensbyxTAGtechnology　ZhengZhibei,ZhengWei,PuXiaoying,WenYanping,PanJincao,WangHaoqiuHangzhouCenterforDiseaseControlandPrevention,Hangzhou310021,ChinaCorrespondingauthor:ZhengZhibei,Email:[e-mail]【Abstract】　Objective　Todevelopamicrosphere-basedsuspensionarrayforsimultaneousdetec-tionandidentificationofSalmonellaHantigensbyusingLuminexxTAGtechnologyandtoevaluateitscapa-bilityinserotypingSalmonellastrains.Methods　ThefliCandfljBgenes,encodingtheHantigenofSalmo-nella,wereselectedasthetargetgenes.Universalupstreamprimersweredesignedbasedonthehighlycon-servedregionsoffliCandfljBgenes,andthecorrespondingspecificreverseprimersweredesignedbasedonthevariableregions.Whilesynthesizing,the5′endofeachupstreamprimerwaslabeledwithbiotinandthe5′endofeachspecificreverseprimerwasmodifiedwithitscertainTAGsequence.Afteramplifiedandla-beledwithbiotinandTAGsequence,thePCRproductsofspecimenswerehybridizedwiththemixtureofva-riousMagPlex-xTAGTMmicrospheres.Eachsetofmicrospherescontaineditsuniqueanti-TAGsequences.TheresultsofhybridizationwereanalyzedbyusingLuminexMagPixreadersystemandthemedianfluores-cenceintensity(MFI)wasreported.TheHantigensof145Salmonellastrainswereidentifiedwiththisde-velopedxTAGsuspensionarray,andtheresultswerecomparedwiththoseobtainedbyusingtraditionalser-umagglutinationtest.Results　ThePCRproductsofdifferentHantigensrangedfrom94bpto245bpandcouldbeidentifiedbyhybridizingwithMagPlex-xTAGTMmicrospheres.Therewasnocross-reactionbetweendifferentHantigensorwithDNAsderivedfromEscherichiacoli,Vibriocholerae,VibrioparahaemolyticusandShigellaflexneri.Comparedwiththetraditionalserumagglutinationtest,thesensitivityandspecificityofthexTAGsuspensionarrayintheidentificationofHantigensof145Salmonellastrainswere95.1%and100%,respectively.Conclusion　ThedevelopedxTAGsuspensionarraywasaspecific,accurateandeffectivemethodforsimultaneousdetectionandidentificationof31HantigensofcommonSalmonellaserovarsstrains.ItcouldbeusedfordeterminingtheHantigensofmorethan90Salmonellastrainswithin5hours.【Keywords】　Salmonella;Hantigen;xTAGtechnologyFundprogram:ScientificResearchFundforHealthcareandKeyDiseasesProgramofHangzhouSci-enceandTechnologyBureauofZhejiangProvince(20140633B24)·249·中华微生物学和免疫学杂志2016年12月第36卷第12期　ChinJMicrobiolImmunol,December2016,Vol.36,No.12　　沙门菌的血清型别与其致病性、耐药性、宿主范围等密切相关,对分离到的沙门菌进行血清学分型,是沙门菌监测中必不可少的工作。传统的沙门菌血清学分型方法是血清凝集试验,先根据其菌体抗原(O抗原)分群,再根据鞭毛抗原(H抗原)分型。因H抗原的特性及血清凝集试验本身的局限性,在实际工作中存在诸多问题:(1)H抗原与相应抗血清呈絮状反应,其反应结果不如O抗原的颗粒状凝集明显,结果判断受个人经验和主观影响较大;(2)部分沙门菌的H抗原需经1次或数次位相诱导后才能凝集,操作繁琐耗时;(3)不同H抗原间常存在交叉凝集反应。随着分子生物学技术的发展,基于DNA分析的沙门菌检测及血清分型方法相继出现,如普通PCR法、荧光PCR法、测序分析等,此类方法均以沙门菌相关特异基因序列为目标,为沙门菌的血清型别鉴定提供了新思路,但大多局限于单个或少数几个血清型的鉴别,难以实现多株菌、多种血清型别的同时鉴定[1-2]。本研究利用基于液态悬浮芯片原理的LuminexxTAG技术,以编码沙门菌H抗原的fliC和fljB基因为目标基因,建立能高通量鉴别沙门菌多种H抗原基因的xTAG技术,用于常见沙门菌血清型H抗原的鉴定,取得较好结果。现报道如下。材料和方法菌株来源和鉴定:鼠伤寒沙门菌CMCC50013、肠炎沙门菌CMCC50335、伤寒沙门菌CMCC50071由中国医学细菌保藏管理中心提供,布伦登卢普沙门菌H9812株由中国疾病预防控制中心惠赠;145株沙门菌分离自浙江省杭州市2014—2015年食物中毒或食源性疾病主动监测标本,菌株的分离培养与鉴定按照《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》(GB4789.4-2010)及《感染性腹泻诊断标准》(WS271-2007)进行,生化鉴定使用VITEK2Compact全自动微生物鉴定系统(BioMérieux,法国),血清分型采用丹麦SSI沙门菌血清型鉴定用诊断血清。对照菌株为大肠埃希菌ATCC25922、霍乱弧菌(分离株HZ09019)、副溶血性弧菌ATCC17802及志贺菌CMCC51572。主要试剂和仪器:HotStartVersionExTaq聚合酶及缓冲液(TaKaRa,大连);MagPlex-xTAGTMmi-crosphere和LuminexMagPix液态悬浮芯片系统(Luminex,美国);链霉亲和素-藻红蛋白(Streptavi-din-R-phycoerythrin,SAPE)(Invitrogen,美国);引物及其标记由上海生工生物技术有限公司合成;菌液比浊仪(BioMérieux,法国);S1000PCR扩增仪(Bio-Rad,美国)。引物设计与合成:以沙门菌编码H抗原的fliC基因和fljB基因为目标基因,从GenBank中下载各H抗原的基因序列;Bio-Edit软件进行多序列比对,用PrimerPremier6软件在其保守片段设计通用的上游引物,在其可变片段设计特异的下游引物;根据Luminex公司提供的MagPlex-xTAGTM磁珠清单及其anti-TAG序列,为每条特异性引物选择合适的TAG序列;用Oligo7软件对各引物的二聚体、发夹结构、错配情况及GC含量、Tm值等进行评价,并经BLAST验证各引物对的特异性。共筛选出37条引物,其中F1为R1~R20共20条特异引物的共同上游引物,F2、F3分别为R21~R24、R25~R28特异引物的共同上游引物(表1)。合成时上游引物的5′端用生物素标记,下游引物的5′端连接特定的TAG序列(与Luminex公司提供的特定编号MagPlex-xTAGTM磁珠上的anti-TAG序列互补),TAG序列与引物之间用C12间隔。菌株DNA提取:分离的菌株经营养肉汤培养18~24h后,调节菌液浓度至106CFU/ml,取1.0ml经10000r/min离心4min,弃上清后加200μl灭菌纯水混悬,100℃加热10min,再10000r/min离心4min,取上清液作为PCR模板。PCR反应体系及条件:将37条引物分成2个PCR反应体系(表1),25μl的反应体系中加10×Buffer2.5μl,dNTPs(各2.5mmol/L)2.0μl,体系1中上游通用引物(1条,10μmol/L)0.75μl,下游特异性TAG引物混合液(共20条,各5μmol/L)1.0μl,体系2中上游通用引物(共2条,各10μmol/L)0.75μl,其余引物混合液(共14条,各5μmol/L)1.0μl,HSExTaq酶(5U/μl)0.125μl,模板2.0μl,不足部分用双蒸水补足。PCR扩增条件:94℃预变性1min,94℃变性30s,54℃退火30s,72℃延伸30s,35个循环,最后在72℃延伸5min。磁珠杂交及信号检测:临用前将各种编码的MagPlex-xTAGTM磁珠混合,使