IHC步骤

免疫组化【步骤】1.烤片，58℃，1hr-过夜(肉眼观察组织表面的蜡融化彻底即可)。2.石蜡切片脱蜡至水：依次将载玻片放入二甲苯Ⅰ—二甲苯Ⅱ—二甲苯Ⅲ—无水乙醇Ⅰ—无水乙醇Ⅱ—95%乙醇—90%乙醇—80%乙醇—70%乙醇—自来水—蒸馏水Ⅰ—蒸馏水Ⅱ，二甲苯每个10min，其余每个放5min。蒸馏水洗，3min×3次。3.抗原修复(高压修复法)：在高压锅中加入抗原修复液（pH6.0枸橼酸盐后者柠檬酸盐抗原修复液），虚盖盖放电磁炉上加热至沸腾。将脱蜡水化后的组织切片放入已沸腾的缓冲液中，盖紧盖子，稍停等气嘴顶起，加限压阀，高压锅喷气后计数2min，停火；抗原修复后玻片自然冷却至室温（25-30℃）(约1hr）。取出玻片，PBS洗，5min×3次。(有些抗原可不用修复，视抗原情况而定)4.将玻片放入3%H2O2浸泡20min，去除内源性过氧化物酶，倒掉H2O2，PBS洗，5min×3次。△注：3%H2O2要现用现配，洗H2O2时用的PBS要与洗其它用的PBS分开。5.血清封闭：加入非免疫山羊血清，室温孵育10min。6.加一抗：取出载玻片，置于湿盒中，用吸水纸吸干组织表面及周围多余的血清，加一抗，对照组织加PBS，37℃孵育1h(或4℃过夜)。将载玻片从温箱中取出，PBS洗，5min×3次。注意观察，不要干片。△注：①一抗稀释液用pH7.5的PBS，要调好pH，最好高压。如果是用商品化的抗体稀释液，对照组织加抗体稀释液。②试剂要充分覆盖组织，应超出边缘2mm，用PAPPen时要超出3-4mm。7.加二抗：擦干组织周围PBS，滴加二抗后常温孵育30min，PBS洗，5min×3次。8.加DAB显色剂：擦干组织周围的PBS后加DAB显色剂，显微镜下观察显色情况。显色后片子用蒸馏水冲洗5min。9.复染：滴加苏木素染液染色2min，蒸馏水充分冲洗后，入分色液（盐酸酒精）分色20sec，然后蒸馏水冲洗，返蓝液返蓝5min，然后自来水冲洗5-10min。10.脱水：依次将载玻片放入70%乙醇—80%乙醇—90%乙醇—95%乙醇—无水乙醇Ⅰ—无水乙醇Ⅱ—二甲苯Ⅰ—二甲苯Ⅱ。每缸试剂放2min。11.封片，CCD显微镜下观察并摄像。【注意事项】①如果用DAKO试剂盒，则A液是RT孵育30min，显色液是用B液稀释C液(1:100)。如果是选用其他公司的显色剂，则按照说明书使用。②切片在PBS缓冲液或修复液中浸泡过长时间会增加背景着色。③不适当的组织处理可增加胞核着色，如组织在二甲苯中浸泡时间太长(2天)，PBS浸泡时间太长，组织变干，微波修复液的pH值和修复时间不当或修复过程中修复液太少未充分浸过组织等！④要设置阴性对照看是否内源性生物素着色。⑤我们定期（1个月）更换脱蜡或透明使用的二甲苯和水化或者脱水使用的梯度酒精，学生自己可不用更换。⑥DAB为可疑致癌物质，当戴手套操作室注意不要污染台面和显微镜。苏木素—伊红染色（HE染色）【步骤】1.烤片，58℃，1hr-过夜(肉眼观察组织表面的蜡融化彻底即可)。2.石蜡切片脱蜡至水：依次将载玻片放入二甲苯Ⅰ—二甲苯Ⅱ—二甲苯Ⅲ—无水乙醇Ⅰ—无水乙醇Ⅱ—95%乙醇—90%乙醇—80%乙醇—70%乙醇—自来水—蒸馏水Ⅰ—蒸馏水Ⅱ，二甲苯每个10min，其余每个放5min。蒸馏水洗，3min×3次。3.苏木素染色：滴加苏木素染液染色2min，蒸馏水充分冲洗后，入分色液（盐酸酒精）分色20sec，然后蒸馏水冲洗，返蓝液返蓝5min，然后自来水冲洗5-10min。4.伊红染色：0.5%曙红液染色1-3min，自来水冲洗1min。5.脱水：依次将载玻片放入70%乙醇—80%乙醇—90%乙醇—95%乙醇—无水乙醇Ⅰ—无水乙醇Ⅱ—二甲苯Ⅰ—二甲苯Ⅱ。每缸试剂放2min。6.封片，CCD显微镜下观察并摄像。