CTAB法提取RNA

CTAB法提取植物总RNA一、操作步骤：1.先在65oC水浴中预热适量的CTAB提取液（加入2%B-巯基乙醇）；2.液氮中迅速研磨新鲜的（或-70oC保存的）植物组织样品，充分研磨成均匀的粉末后取0.05-0.1g置于1.5mL离心管中（离心管中预先加入1mLCTAB提取液）,迅速涡旋混匀30-60s,然后65oC水浴4-5min;3.加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)涡旋混匀，10000xg离心15min沉淀蛋白质；4.将上清液转移至新的离心管，重复抽提一次，沉淀蛋白质；5.将上清液转移至新的离心管，加入等体积的4mol/LLiCl，4oC条件下沉淀2h以上使RNA变性。6.4oC,12000xg离心10min沉淀RNA，弃上清去除DNA，然后分别用500uL70%和100%的乙醇洗涤沉淀除去杂质；7.倒掉乙醇，瞬时离心，吸干离心管中的液体，超净工作台晾干沉淀，10min。Tips：缓缓倒掉乙醇，避免倒掉沉淀。尽量吸干残留液体，适当调整晾干沉淀的时间，确保乙醇完全挥发。晾干沉淀的时间不宜过长，否则不利于RNA的溶解。8.加入50μLmixture（44μLDEPC-H2O，5μL10×DNaseⅠbuffer，1μLDNaseⅠ），37°C孵育30min。Tips：配置mixture时应先加DEPC-H2O，再加buffer，最后加DNaseⅠ，配制好的mixture应充分混匀后再分装。样品较多时，应计算好mixture的需求量，并适当增加配制量，因为分装mixture时会有损耗。9.加入500μLDEPC-H2O稀释RNA样品，加入200μL氯仿/异戊醇（24/1），缓慢摇匀10min。Tips：需稀释RNA样品，以利于在氯仿/异戊醇抽提后转移上清液。10.4°C，12000×g，离心10min。将上清液转入新离心管，加入1/10体积的2molL-1醋酸钠（pH4.0）和2/3体积的异丙醇，轻柔混匀，静置10min。Tips：需加入醋酸钠，否则可能导致RNA不沉淀。-20°C至室温静置均可，低温可提高RNA得率。11.4°C，12000×g，离心10min，弃上清。加入1mL75%乙醇，颠倒离心管数次，静置10min。Tips：75%乙醇使用量等于Trizol使用量。应使沉淀从离心管壁解离。12.倒掉乙醇，瞬时离心，吸干离心管中的液体，超净工作台晾干沉淀，10min。Tips：缓缓倒掉乙醇，避免倒掉沉淀。尽量吸干残留液体，适当调整晾干沉淀的时间，确保乙醇完全挥发。晾干沉淀的时间不宜过长，否则不利于RNA的溶解。13.加入50μLDEPC-H2O，室温溶解10min。琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，紫外分光光度计检测RNA纯度和浓度。检测合格的RNA样品用于后续分析，或深冷冰箱保存备用。Tips：电泳时应更换新鲜的电泳缓冲液，可使用分子量标准D2000初步判断RNA浓度。合格的RNA样品至少有28S、18S和5S三条带，带型清晰，亮度依次减弱。OD260/OD280指示蛋白质或酚类物质的影响，应约等于2.0；OD260/OD230指示碳水化合物、多肽或苯酚的影响，应略大于2.0；OD320指示溶液的浑浊度和其它干扰因子，应约等于0。OD260指示RNA浓度，1OD260相当于RNA的浓度为40ngμL-1。二、试剂的配制1mol/LTrispH=8.0(25mLSSTE用0.25mL,200mLCTAB提取液用20mL):100mL蒸馏水中加12.114gTris碱，再加DEPC处理过的水至80mL,盐酸调pH至8.0。SSTEbuffer：1.0MNaCl，0.5%SDS，10mMTris-ClpH8.0，1mMEDTA。0.5mol/LEDTA(200mLCTAB中加10mL,25mLSSTE中加0.05mL):50mL蒸馏水中加入9.3gEDTA,然后加入NaOH约1g,加DEPC-H2O40mL,调pH至8.0，定容后加50uLDEPC-H2O。注意：EDTA较难溶，溶解时需要加热。10%SDS(每25mlSSTE加1.25ml):50ml中加入5gSDS，用DEPC－H2O定容至50ml。SDS很难溶，可稍加热。4mol/LLiCl:200mL蒸馏水中加入33.912g无水氯化锂，定容后再加200uLDEPC-H2O,然后灭菌备用。CTAB提取液：2%CTAB,2%PVP,25mMEDTA,100mMTris-Cl(pH8.0),2.0mol/LNaCl,0.5g/LSpermidine（亚精胺），灭菌后加入2%B-巯基乙醇。氯仿/异戊醇（24:1）：将氯仿和异戊醇按体积24:1的比例混匀，置棕色瓶中，4℃保存。酚:氯仿:异戊醇(25:24:1):按饱和酚、氯仿、异戊醇体积比为25:24:1比例混匀，置棕色瓶中，4℃保存。