染色质免疫共沉淀PPT

染色质免疫共沉淀(ChIP)目录一、简介DNA与蛋白质相互作用研究DNaseⅠ足纹法电泳迁移率变动分析生物信息学方法酵母单杂交系统ChIP一、简介ChIP是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达关系。二、原理在活细胞状态下固定蛋白质—DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合物，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片段的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。三、技术流程具体操作流程DNA分析1、甲醛交联细胞具体步骤10ml1×PBS弃上清4-5ml预冷1×PBS预冷1×PBS洗涤两次转移4000rpm离心5min弃上清1ml预冷1×PBS悬浮新离心管4000rpm离心5min1ml1.25mol/L甘氨酸室温10-20min2、染色质超声断裂1.加SDS裂解溶液重悬浮沉淀，冰上10min.每1min颠倒摇动一次离心管。2.把DNA粉碎为长度200-1000bp，置于冰上。不同样本都进行超声条件优化实验。3.14000rpm离心10min（4℃），转移上清于1.5ml离心管。3.免疫沉淀蛋白和DNA复合物超声染色质液体2ml超声稀释液4℃摇床摇动一小时1000rmp离心2min（4℃）转移上清液至新离心管ChIP稀释液稀释10倍加入20μl蛋白A/G琼脂糖珠1-4μl免疫沉淀抗体取50μl上清液作为对照？？4、收获免疫复合物（抗体-蛋白质-DNA）样品摇动1-2h，4℃40μlProteinA/GAgaroseBeads1×PBS洗3次离心1000rpm,1min.弃上清，用4μl1×PBS悬浮1000rpm,离心5min,4℃a低盐洗脱溶液1ml洗一次b高盐洗脱溶液1ml洗一次c氯化锂洗脱溶液1ml洗一次dTE溶液(pH8.0)1ml洗两次每次洗时，在摇床上摇10min,4℃，4000rpm离心5min弃上清5、洗脱免疫复合物Beads200μlChIP洗脱溶液洗脱摇床上摇动10min12000rpm离心1min取上清Beads取上清200μl,ChIP洗脱溶液(3次)600μl洗脱液6、去除甲醛交联①加5mlNaCl使用NaCl终浓度为0.2mol/l②阴性对照+350μlChIP洗脱溶液+16μl5mol/lNaCl。③65℃,过夜,去交联。7、DNA纯化①酚/氯仿抽提实验样本(600μl)50μl阴性对照10μlRNase√√50μl蛋白酶K√√等量酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）√√12000rmp离心5min上清液上清液1/10体积3mol/l乙酸钠√√2倍体积冰冻无水乙醇√√-80℃冰箱1h.12000rmp离心20min，弃上清加入70%乙醇，悬浮沉淀，12000rpm离心10min，去上清，DNA干燥后，40μlTE溶解②硅胶柱纯化8、染色质免疫共沉淀DNA的分析和蛋白质在DNA上结合位点的鉴定(1)如果目的蛋白靶序列已知，或怀疑某一序列是目的蛋白靶序列，则可选用定量或者半定量PCR方法。(2)如果目的蛋白的靶序列未知或者研究目的蛋白基因组分布情况，找出转录因子结合位点，则可采用ChIP克隆测序，ChIP-chip，和ChIP-seq方法。四、应用组蛋白修饰研究转录调控分析药物开发研究有丝分裂研究DNA损伤与凋亡分析五、优缺点优点：充分反映生理条件下DNA与蛋白质相互作用的真实情况，可以找出生理条件下某个DNA结合蛋白与DNA序列的结合位点，从而反映体内基因表达调控的真实情况。缺点：需要一个特异性蛋白质抗体，有时难以获得；为了获得高等丰度的结合片段，必须实验演示胞内条件下靶标蛋白质的表达情况；调控蛋白质的基因获取可能需要限制在组织来源。