色谱基本原理

色谱基本原理第一节色谱法概述4.1.1色谱法的特点、分类和作用俄国植物学家茨维特在1906年使用的装置：色谱原型装置，如图。1、概述色谱法(chromatography)：以试样组分在固定相和流动相间的溶解、吸附、分配、离子交换或其他亲和作用的差异为依据而建立起来的各种分离分析方法称色谱法。有关名词：固定相（stationaryphase）:色谱法中，填入柱管内静止不动的一相（固体或液体）称为固定相。如离子交换树脂法中的树脂相。流动相(mobilephase):携带样品流过固定相的流体（一般是气体或液体）称为流动相。色谱柱(chromatographycolumn):装有固定相的管子称为色谱柱。色谱法的共同特点：任何色谱法都存在两个相，即流动相和固定相；流动相可以是气体或液体，固定相为固体或涂渍在固体表面的高沸点液体；流动相对固定相作相对运动，它携带样品通过固定相；被分离样品中各组分与色谱两相间具有不同的作用力，这种作用力一般表现为吸附力或溶解能力，正是这种作用力的差异导致通过各组分通过固定相时达到彼此分离。2、色谱法分类（1）气相色谱：流动相为气体（称为载气）。按分离柱不同可分为：填充柱色谱和毛细管柱色谱按固定相的不同又分为：气固色谱和气液色谱（2）液相色谱：流动相为液体（也称为淋洗液）。按固定相的不同分为：液固色谱和液液色谱。(3)其他色谱方法：薄层色谱和纸色谱、凝胶色谱法、高效毛细管电泳法等。第二节气相色谱法(GC)GasChromatography（1）分离效率高：复杂混合物，有机同系物、异构体。手性异构体。（2）灵敏度高：可以检测出μg.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量.（3）分析速度快：一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。（4）应用范围广：适用于沸点低于400℃的各种有机或无机试样的分析。不足之处：不适用于高沸点、难挥发、热不稳定物质的分析。被分离组分的定性较为困难。1、气相色谱法的特点4.2.1概述2、气相色谱分离过程当试样由载气携带进入色谱柱与固定相接触时，被固定相溶解或吸附。随着载气的不断通入，被溶解或吸附的组分又从固定相中挥发或脱附，挥发或脱附下的组分随着载气向前移动时又再次被固定相溶解或吸附。随着载气的流动，溶解、挥发，或吸附、脱附的过程反复地进行。3、分配系数K组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、挥发的过程叫做分配过程。在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度（单位：g/mL）比，称为分配系数，用K表示，即：组分在流动相中的浓度组分在固定相中的浓度K分配系数K的讨论一定温度下，组分的分配系数K越大，出峰越慢；试样一定时，K主要取决于固定相性质；每个组份在各种固定相上的分配系数K不同；选择适宜的固定相可改善分离效果；试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础；某组分的K=0时，即不被固定相保留，最先流出。组分在流动相中的浓度组分在固定相中的浓度K4.2.2气相色谱仪HP5890色谱仪福立GC9790色谱仪气相色谱仪通常由五部分组成：Ⅰ载气系统：气源、气体净化器、供气控制阀门和仪表。Ⅱ进样系统：进样器、汽化室。Ⅲ分离系统：色谱柱、控温柱箱。Ⅳ检测系统：检测器、检测室。Ⅴ记录系统：放大器、记录仪、色谱工作站。气路系统载气:气相色谱中常用的载气有氮气，氦气和氩气。气路结构:主要有两种气路形式单柱单气路，适用于恒温分析双柱双气路，适用于程序升温，并能补偿固定液的流失使其基线稳定。净化器:主要用来提高载气纯度。稳压恒流装置:稳定载气流速。进样系统Dissolvedinanorganicsolvent.Injectedintothecarriergasflowbysyringeorvalve.包括进样装置和气化室分离系统气相色谱的分离系统是色谱柱，常用的色谱柱有填充柱和毛细管柱两种：填充柱是以固体吸附剂或涂渍了固定液的载体颗粒填充到柱管内形成的柱子；毛细管柱内没有填充颗粒，是将固定相涂渍或者以化学键合方式附着到管内壁上。由于混合物各组分的分离在这里完成，所以它是色谱仪中最重要的部件之一。气液色谱填充柱的固定相通常由一种惰性多孔固体（称为担体）及在其表面上涂渍一层较薄的高沸点有机物（称为固定液）液膜构成。1、担体提供一个大的惰性表面，以便使涂渍的固定液膜有足够的容量。担体应具有化学稳定性好、热稳定性好、有一定的机械强度、合适的颗粒及均匀的粒径。常用的有硅藻土类。2、固定液对色谱分离起着决定性作用。应具有化学稳定性、热稳定性好、蒸汽压低、对分析样品有适合的溶解能力，并有高的选择性。固定液在操作温度下是一种液体，柱温不能超过固定液的最高使用温度，否则会使它大量随载气流失。温控系统温控系统是用来设定，控制，测量色谱柱炉、气化室、检测室三处的温度。气化室的温度应使试样瞬时气化而又不分解。在一般情况下，气化室的温度一般应比试样中最高组分沸点高20-30C左右，比柱温高1050C。热导池检测器thermalconductivitydetector,TCD氢火焰离子化检测器flameionizationdetector,FID电子捕获检测器electron-capturedetector,ECD热离子化检测器thermionicdetector,TID火焰光度检测器flamephotometricdetector,FPD检测器热导池检测器TCD工作原理：被分离的组分具有与载气不同的热导系数，当检测器的金属丝被加热并温度达到恒定后，通过热导池的载气组成若发生变化就会带走与载气不同的热量，从而引起热敏元件阻值的变化。氢火焰离子化检测器FID工作原理：以氢气和空气的混合物燃烧火焰为能源，将进入检测器的有机物离子化，生成许多离子对，带电离子被安装在检测器上的电极吸引产生微弱的电流，经放大被记录仪记录。对含碳物质检测灵敏度高，而对不含碳物质无响应。4.2.3色谱理论基础1、气相色谱流出曲线流动相带着组分通过色谱柱到达监测器时，由记录仪得到的信号－时间曲线。基线：无试样通过检测器时，检测到的信号即为基线。基线漂移：基线随时间定向缓慢地变化。基线基线漂移2、色谱术语峰高h（peakhight）：峰的顶点到峰底之间的垂直距离。峰面积A（peakarea）：峰与峰底之间的面积。保留值A、时间表示的保留值保留时间（tR）：组分从进样到柱后出现浓度极大值时所需的时间死时间（tM）：不与固定相作用的气体（如空气）的保留时间。调整保留时间（tR＇）：tR＇=tR－tMB、用体积表示的保留值保留体积（VR）：VR=tR×F0（F0为色谱柱出口处的载气流量，单位：mL/min。）死体积（VM）：VM=tM×F0调整保留体积（VR＇）：VR＇=VR－VM组分2与组分1调整保留值之比：r21=t’R2/t’R1=V’R2/V’R1相对保留值只与柱温和固定相性质有关，与其他色谱操作条件无关，它表示了固定相对这两种组分的选择性。C.相对保留值r21色谱分析的实验依据：１、根据色谱峰的位置（保留时间）可以进行定性分析。2、根据色谱峰的面积或峰高可以进行定量分析。3、根据色谱峰的展宽程度，可以对某物质在实验条件下的分离特性进行评价。3、色谱分析的基本理论(1)热力学理论：塔板理论——平衡理论把色谱分离的过程模拟为精馏塔的分离过程，把色谱柱比作一个精馏塔。（2）动力学理论：速率理论4、色谱操作条件的选择(1)、固定相的选择气－液色谱，应根据“相似相溶”的原则①分离非极性组分时，通常选用非极性固定相。各组分按沸点顺序出峰，低沸点组分先出峰。②分离极性组分时，一般选用极性固定液。各组分按极性大小顺序流出色谱柱，极性小的先出峰。③分离非极性和极性的（或易被极化的）混合物，一般选用极性固定液。此时，非极性组分先出峰，极性的（或易被极化的）组分后出峰。④醇、胺、水等强极性和能形成氢键的化合物的分离，通常选择极性或氢键性的固定液。⑤组成复杂、较难分离的试样，通常使用特殊固定液，或混合固定相。(2)、柱长和柱内径的选择增加柱长对提高分离度有利，但组分的保留时间tR↑，且柱阻力↑，不便操作。柱长的选用原则是在能满足分离目的的前提下，尽可能选用较短的柱，有利于缩短分析时间。填充色谱柱的柱长通常为1~3米，内径3~4厘米。(3)、柱温的确定首先应使柱温控制在固定液的最高使用温度（超过该温度固定液易流失）和最低使用温度（低于此温度固定液以固体形式存在）范围之内。柱温升高，分离度下降，色谱峰变窄变高。柱温↑，被测组分的挥发度↑，即被测组分在气相中的浓度↑，K↓，tR↓，低沸点组份峰易产生重叠。柱温↓，分离度↑，分析时间↑。对于难分离物质对，降低柱温虽然可在一定程度内使分离得到改善，但是不可能使之完全分离，这是由于两组分的相对保留值增大的同时，两组分的峰宽也在增加，当后者的增加速度大于前者时，两峰的交叠更为严重。柱温一般选择在接近或略低于组分平均沸点时的温度。组分复杂，沸程宽的试样，采用程序升温。程序升温(1)、色谱定性鉴定方法A.利用纯物质定性的方法利用保留值定性：通过对比试样中具有与纯物质相同保留值的色谱峰，来确定试样中是否含有该物质及在色谱图中的位置。不适用于不同仪器上获得的数据之间的对比。利用加入法定性：将纯物质加入到试样中，观察各组分色谱峰的相对变化。B.利用文献保留值定性相对保留值r21：相对保留值r21仅与柱温和固定液性质有关。在色谱手册中都列有各种物质在不同固定液上的保留数据，可以用来进行定性鉴定。5、色谱定性、定量分析方法C.与其他分析仪器联用的定性方法小型化的台式色质谱联用仪（GC-MS）色谱-红外光谱仪联用仪；组分的结构鉴定SampleSample58901.0DEG/MINHEWLETTPACKARDHEWLETTPACKARD5972AMassSelectiveDetectorDCBAABCDGasChromatograph(GC)MassSpectrometer(MS)SeparationIdentificationBACDA.外标法将待测组分的纯物质配成不同浓度的标准溶液，使浓度与待测组分接近，然后取固定量的上述溶液进行色谱分析，得到各标准样品的对应色谱图。图某组分的标准物质的色谱图(2)、色谱定量分析方法外标法（续）再在同样的条件下（同样的色谱操作条件和进同样的体积），分析待测试样，得到色谱图。图某样品的色谱图外标法（续）以标准样品的色谱峰面积作图，得到一条标准曲线，再在标准曲线上根据待测样品的峰面积查出待测组分的浓度。图标准（工作）曲线图外标法的特点：操作简单，因而适用于工厂的控制分析和自动分析，但结果的准确度取决于进样量的重现性和操作条件的稳定性。B.内标法内标物要满足以下要求：（1）试样中不含有该物质；（2）与被测组分性质比较接近；（3）不与试样发生化学反应；（4）出峰位置应位于被测组分附近，且无组分峰影响。试样配制：准确称取一定量的试样W，加入一定量内标物mS计算式：SsiisiSsiisiAfAfmmAfAfmm'''';100100100%''''SsiisSsiisiiAfAfWmWAfAfmWmc内标法特点1.内标法的准确性较高，操作条件和进样量的稍许变动对定量结果的影响不大。2.每个试样的分析，都要进行两次称量，不适合大批量试样的快速分析。3.若将内标法中的试样取样量和内标物加入量固定，则：常数SiiAAc%第三节高效液相色谱（HPLC）液相色谱仪4.3.1高效液相色谱法的特点特点：高压、高效、高速高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。高效液相色谱法：特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。它在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实验技术建立的一种液相色谱分析法。高压：150-350*105Pa高效：大于30000塔板/米高灵敏：10-9g（紫外检测）、10-11g（荧光