实验6-大肠杆菌感受态细胞的制备与转化

实验六大肠杆菌感受态细胞的制备和转化基因工程的基本路线PCR质粒DNA提取和酶切连接转化操作步骤（一）受体菌的培养1、－70℃或－20℃低温冰箱取出菌种后，在LB培养液中培养过夜，进行活化;2、取几微升活化后的菌液（取量视菌的密度而定）在LB平板上涂布,于37℃培养箱中培养24h；从LB平板上挑取单菌落,接种于3-5mlLB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。3、将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600＝0.5左右(生长对数期）。（注：这一步非常关键。培养过度的菌液含有较多的“老”细胞，制备成感受态细胞后其接受外援DNA能力较低，从而导致转化率降低。）（二）、感受态细胞的制备(CaCl2法)1、将1.5ml菌液移入离心管中，冰上放置10分钟，然后于4℃下5000rpm离心5分钟。2、弃去上清（轻轻倾倒掉上清液，并用吸水纸或移液器移除残余的过多水分）。3、加入1ml预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液，轻轻拨动管底使细胞完全悬浮,冰上放置15分钟后,4℃下5000rpm离心5分钟。3、弃去上清,加入0.2ml预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液,轻轻悬浮细胞，即制成感受态细胞。将感受态细胞悬液分装成2份(1.5ml管)，每份100μl（注意悬液密度要均匀）。冰上放置备用。4、暂时不用的感受态细胞可置于-80℃保存。注：CaCl2处理后的细胞比较脆弱，尽量温柔操作！（三）质粒pUC19的转化（两人一组，1人做质粒转化，1人做对照）1.质粒和感受态细胞混和：分别在100μl感受态细胞悬液中加入下列DNA质粒或水，轻轻摇匀后冰上放置30分钟。感受态细胞+pUC19质粒2μl(10ng/ul,含量不超过50ng,体积不超过10μl)感受态细胞+无菌水2μl（阴性对照）2.热击：42℃水浴中热击90秒（注：精确计算时间，过长将对细胞造成伤害）,热击后立即置于冰上冷2-5分钟（禁止摇动）。3.复苏：向每管中加入400μlLB液体培养基(注：不含Amp),混匀后37℃轻摇培养1~1.5小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr)。实验目的掌握氯化钙法制备与转化感受态细胞的原理、方法和技术。学会对质粒转化结果的评估。实验原理转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。细胞经过一些特殊方法（电击法、CaCl2法等处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的细胞，即感受态细胞(Compenentcells)。0.1mol/LCaCl2是一种低渗溶液,在0℃冷冻处理大肠杆菌细胞时,细胞膨胀成球形，DNA可吸附在其表面。在短暂的热冲击下，细胞可吸收外源DNA。摄入了外援DNA的细胞在丰富培养基内复制并增殖，表达外源基因。带有选择标记基因的外源载体在受体细胞内表达时，受体细胞表现标记基因的表型，使转化子与非转化子在选择培养基上区分开来。Ampr：抗氨苄青霉素–β内酰胺酶:一类具有不同底物专一性、催化水解β内酰胺的酶多克隆位点：外源DNA片段的插入位点Amps菌株Ampr涂布于含Amp的培养基上，可以生长。次日可见白色菌落--转化子。培养基上含有X-Gal和IPTG时，可使用蓝白斑筛选方法鉴别真正的重组的转化子。蓝白斑筛选的原理（α-互补）pUC19载体带有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框；宿主细胞编码β-半乳糖苷酶C端部分序列。这样，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶（β-半乳糖苷酶）活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这种现象称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。蓝白斑筛选的原理（α-互补）现在使用的许多载体都带有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框；宿主细胞编码β-半乳糖苷酶C端部分序列。这样，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶（β-半乳糖苷酶）活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这种现象称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。材料、设备及试剂材料E.coliDH5α菌株:R-、M-、Amp-(转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。）pUC19质粒DNA（浓度：10ng/μl):购买或实验室自制设备：恒温摇床；电热恒温培养箱；台式高速离心机；无菌工作台；低温冰箱；恒温水浴锅；分光光度计；微量移液枪。试剂1、LB固体和液体培养基LB培养基配方：（单位g/L）胰蛋白胨10酵母提取物5NaCl10琼脂（1.5%）15g（注：LB培养液不加琼脂）按配方称量药品,加入一定量的ddH2O后置电炉上加热熔解琼脂，待琼脂完全熔解后加入ddH2O定容至1000ml,用NaOH调节pH至7.0。121℃湿热高压灭菌20-30分钟，待冷却至60℃左右,在超净工作台中加入一定量的Amp储存液,使终浓度为100μg/ml,摇匀后用培养皿铺板。2、Amp母液：称取氨苄青霉素100mg溶于1mlddH2O中，0.22μm滤器过滤除菌，用EP管分装后储存于-20℃冰箱.3、0.1mol/LCaCl2溶液:称0.56gCaCl2(无水分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,用0.22μm滤器过滤除菌or高压灭菌。EP管分装于0℃冰箱储存.4、标准pUC19质粒：浓度10ng/μl操作步骤（一）受体菌的培养1、－70℃或－20℃低温冰箱取出菌种后，在LB培养液中培养过夜，进行活化;2、取几微升活化后的菌液（取量视菌的密度而定）在LB平板上涂布,于37℃培养箱中培养24h；从LB平板上挑取单菌落,接种于3-5mlLB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。3、将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600＝0.5左右(生长对数期）。（注：这一步非常关键。培养过度的菌液含有较多的“老”细胞，制备成感受态细胞后其接受外援DNA能力较低，从而导致转化率降低。）（二）、感受态细胞的制备(CaCl2法)1、将1.5ml菌液移入离心管中，冰上放置10分钟，然后于4℃下4000rpm离心5分钟。2、弃去上清（轻轻倾倒掉上清液，并用吸水纸或移液器移除残余的过多水分）。3、加入1ml预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液，轻轻拨动管底使细胞完全悬浮,冰上放置15分钟后,4℃下4000rpm离心5分钟。3、弃去上清,加入0.2ml预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液,轻轻悬浮细胞，即制成感受态细胞。将感受态细胞悬液分装成2份，每份100μl（注意悬液密度要均匀）。冰上放置备用。4、暂时不用的感受态细胞可置于-80℃保存。注：CaCl2处理后的细胞比较脆弱，尽量温柔操作！（三）质粒pUC19的转化1.质粒和感受态细胞混和：分别在100μl感受态细胞悬液中加入下列DNA质粒或水，轻轻摇匀后冰上放置30分钟。感受态细胞+pUC19质粒2μl(10ng/ul.含量不超过50ng,体积不超过10μl)感受态细胞+无菌水2μl（阴性对照）2.热击：42℃水浴中热击90秒（注：精确计算时间，过长将对细胞造成伤害）,热击后立即置于冰上冷2-5分钟（禁止摇动）。3.复苏：向每管中加入400μlLB液体培养基(注：不含Amp),混匀后37℃轻摇培养1~1.5小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr)。（四）涂布平板筛选转化质粒1.将上述2管培养液，分别取50ul、100ul涂布于含Amp的筛选平板上，其中阴性对照只取100ul涂布。（注：1.将培养液摇匀后涂布；2.为了便于计算转化率，必须获得分散的、独立的菌落用于计数。所以涂布时尽量将50μl的培养液均匀涂布于培养基的表面，使之尽量分散。）2.正面向上放置15分钟,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养过夜。（五）次日（12-14小时后）观察和计算转化率：观察记录转化情况并统计转化率。转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：转化子总数＝该皿的菌落数×稀释倍数（注：稀释倍数=涂布前总体积／涂板用菌液体积）转化频率＝转化子总数／质粒DNA加入量(μg)（注：理想值可达5×106～2×107转化子/μgDNA）预期实验结果实验报告（4）计算转化率并根据转化率和阴性对照分析实验结果。思考题(1).根据本实验你认为影响转化率的因素有哪些？(2).如果实验中对照组本不该长出菌落的平板上长出了一些菌落，你将如何解释这种现象？实验中要考虑的重要因素为了提高转化效率,实验中要考虑以下几个重要因素：1.细胞生长状态和密度:不要用经过多次继代或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。DH5α菌株的OD600为0.5时,细胞密度在5×107个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。2.质粒的质量和浓度:用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50μl的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。3.试剂的质量:所用的试剂,如CaCl2等均需是最高纯度的，并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。4.防止杂菌和杂DNA的污染：严格来说，整个操作过程均应在无菌条件下进行,所用器皿,如离心管,tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染,否则均会影响转化效率或杂DNA的转入,为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。