第十章 植物的脱毒培养

21第十章植物组织的脱毒培养第一节植物病毒的危害病毒:一类结构简单生物，由核酸和蛋白质分子组成。病毒结构简单，没有完整的酶系统来独立地进行物质代谢和能量代谢，只能依靠寄主生物的酶系统实现生理代谢过程，因此，具有寄生性。病毒侵入寄主后，在寄主细胞中进行自我复制而迅速增殖，并扩展到植物全株发病。病毒病不同于真菌和细菌病害，不能用杀菌剂和抗菌素进行防治，与细胞共生，一旦染病，只能采用拨除病株的措施。病毒危害：1）导致植物产量和品质的大幅度降低。2）通过无性繁殖或者种子传给下一代。荷兰（1619）最早记载植物病毒病是郁金香碎色花病。20世纪50年代初，法国的Morel利用茎尖培养法，从患病的大丽花（西番莲）获得了无病毒植株。发现通过植物组织培养方法，可脱除植物病毒，恢复种性，提高产量质量。马铃薯、甘薯、百合、草莓、大蒜、兰花、苹果等。第二节病毒的侵染途径一、植物病毒的侵染来源主要有：①大田病株和野生寄主；②带病毒作物的无性繁殖器官、种子和花粉；③昆虫及其它生物的传播；200余种蚜虫可以传播160多种病毒，仅桃蚜能传播100多种病毒。④土壤种病残体和微生物种存活的病毒。使优良品种的生产力衰退，成为优良品种退化劣变的主要原因。二、病毒的分布病毒在植物中分布不均匀，在顶端分生组织中含毒少，在老组织中病毒增加。植物茎尖分生组织无病毒的原理（原因）：①病毒一般通过维管系统在植株体内移动，而分生组织中没有该系统。②分生组织中细胞分裂旺盛，代谢活性高，病毒无法在其中复制。③茎尖存在高水平的内源生长素，可抑制病毒的复制。第三节脱除植物病毒的方法一．茎尖培养脱毒(一)根据培养目的和取材大小可将茎尖培养分为:1.普通茎尖（Shoottip）培养。较大茎尖（几毫米至几十毫米的茎尖）培养技术。技术简单，操作方便，茎尖易成活，成苗所需时间短，能加速繁殖速度。2.茎尖分生组织(apicalmeristem)培养。仅限于幼龄叶原基顶端圆锥区，其直径和长度大约100～250μm，即小于0.3mm的茎尖为茎尖分生组织。马铃薯病毒：PVX：马铃薯X病毒，也称马铃薯普通花叶病毒，主要症状表现为叶脉间花叶。PVY：马铃薯Y病毒，也称马铃薯重花叶病毒，主要症状表现为轻花叶或茎粗缩，严重时坏死。PVS：马铃薯S病毒，也称马铃薯潜隐性花叶病毒，症状表现为叶脉深陷粗缩。PLRV：马铃薯卷叶病毒，表现症状为叶缘向上卷曲形成管状，病叶小，叶质脆弱，病株呈扫帚状。大多数品种初侵染时叶尖呈浅黄白色，有些品种呈紫色或红色。PSTV：马铃薯纺锤形块茎类病毒，症状主要表现在块茎上，病薯呈纺锤形，常发生龟裂畸形，茎叶上症状表现轻微。马铃薯脱毒苗：指对马铃薯块茎进行病毒钝化、催芽处理后，通过茎尖剥离、分生组织培养而脱去PVX、PVY、PVS、PLRV和PSTV等病毒、类病毒的试管苗及其扩繁苗。（二）在茎尖培养中影响脱毒的因素1、培养基：营养成分：MS培养基，K+NH4+含量生长调节剂：少量的生长素（NAA,IAA)、细胞分裂素（6-BAP）、GA32、外植体的大小：决定存活率的大小三个因素：根除病毒、可以发育为完整植株的能力、带有叶原基。3、培养条件：25±2℃光照4000lx4、外植体的生理状态：顶芽茎尖比腋芽茎尖效果好。生长期的材料比休眠期好。二、热处理脱毒热处理（heattreatment）与茎尖培养结合，可即取较大的茎尖培养，大大提高茎尖成活率和增殖率，又达到消除病毒的目的。印度尼西亚的爪哇人（1889），甘蔗的枯萎病，在50-52℃热水中，30min，即可使甘蔗生长良好，达到脱除枯萎病的作用。1、方法：热水---休眠芽热气---活跃的茎尖。温度35-50℃，处理的时间长度不一。可以逐渐升温，也可采取变温处理。香石竹：38℃，2个月；马铃薯（X、Y病毒）：在芽长至1-2cm，35℃，7-28天；菊花：50℃，3-15min。2、热处理脱毒的原理：⑴某些病毒受热后不稳定，高温使这些病毒失去活性，可以部分地或完全地被钝化。⑵病毒进入植物细胞后，随植物细胞的DNA一起复制。热处理钝化病毒的活性后，病毒在植物体内增殖减缓或增殖停止，而失去侵染的能力。⑶高温下，一方面不能生成或生成病毒很少，另一方面对病毒的破坏作用加重，病毒颗粒生成和破坏的平衡程度受到破坏，使感染植株的病毒含量不断降低，经过一段时间，病毒自行消失而达到脱毒的目的。三、愈伤组织脱毒研究表明，在愈伤组织培养过程中，随着愈伤组织的迅速增生，病毒感染的程度会明显降低。经过多次继代培养，新产生的愈伤组织的分散程度增加，染病的几率会越来越小，从愈伤组织诱导生产的试管苗，就会得到脱毒的再生植株。原因：①细胞的增殖速度快于病毒复制的速度，②细胞生产变异，获得对病毒感染的抗性，最终表现出脱毒现象。四、微体嫁接脱毒微体嫁接法：将茎尖（0.2mm）作为接穗嫁接到实生苗砧木上，一起在培养基上培养的方法。适用茎尖难以生根形成植株的一些木本植物。此方法消病毒的几率和获得无病毒苗的可能性大，在柑橘和苹果上获得成功。利用这个方法，柑橘类嫁接成活率为30%～50%，移栽成活率约95%，嫁接两年后即可结实。柑橘的银屑病、桃树的洋李环斑病毒、洋李矮萎缩病毒褪绿叶斑病毒都可以通过微体嫁接获得无病毒苗。五、珠心胚培养脱毒珠心组织与维管束没有联系，故可以培养珠心组织得到无病毒植株。如柑橘类多胚品种中除一个受精胚外，尚有多个有珠心细胞形成的无性胚，称为珠心胚。珠心胚与维管束系统无联系，因此由此产生的植株全部为无病毒的植株。六、化学疗法：在培养基中加入一定浓度的2-硫脲嘧啶，可消除烟草组织中的PVY病毒。病毒抑制剂：2，4-D、碱性孔雀绿等。第四节无病毒植株的鉴定1直接测定法：形态、症状2指示植物法指示植物：接种后某种病毒能迅速表现特有症状的植物。如：千日红、苋色藜、灰藜等植物。病毒可以在指示寄主植物上产生典型或特异的病毒病症状，利用这一原理，将待测植物的汁液接种到寄主植物上，根据侵染与否以及侵染程度来确定脱毒效果。例如，PVX感染千日红植物后，表现红色环状斑纹。SwPLV感染苋色藜后出现枯斑。指示植物分为两种类型：①在接种后产生系统的症状，并扩张到非接种部位；②只在接种部位产生局部病斑。根据病毒的不同类型出现坏死、褪绿或环状病斑来进行比较和判断。3血清鉴定法植物病毒是由蛋白质和核酸组成的核蛋白，是较好的抗原(antigen）。给动物注射病毒后，动物在外来抗原刺激下产生的免疫球蛋白，叫做抗体，存在于血清中。含抗体的血清为抗血清。抗血清的制备：纯化的病毒注射到实验动物中，一段时间后采集血清。血清鉴定方法的原理：主要根据抗体和抗原的特异沉淀反应。具体方法有：试管沉淀、琼脂双扩散法、免疫扩散、ELISA等。酶联血清免疫吸附反应鉴定法（ELISA）ELISA是采用酶标记的抗体来指示抗原抗体结合的微量测定法。①将抗体固定在支持物上，②加入被检测的植物提取液，③然后加酶（某种过氧化物酶或碱性磷酸酶）标记的抗体，④最后加入该种酶反应底物。如果试样存在病毒（抗原），那么抗原和抗体就会结合，这样加入的酶反应底物就会被标记在抗体上的酶分解，根据反应溶液的色泽的变化进行定性或定量分析。用分光光度计鉴定，灵敏度极高。这一方法在检测大量样本时特别实用。酶联免疫原理示意图ELISA-flash4、电子显微检测法采用透射电镜的方法，可直接检测出有无病毒的存在，可得知病毒的大小、形状、结构，并能观察到病毒在器官和细胞内的分布情况。电子显微镜分辨能达到0.5μm，可显示细胞与组织中病毒的精确定位和各种形态变化。5、核酸分析法：通过核酸杂交或PCR法检测目标病毒的核酸序列。第五节无病毒植株的快繁与保存培养快繁茎尖培养过程，如生长慢，茎尖无明显膨大，表明生长素浓度过低或温度低，应调节二者加以改善;如茎尖生长过旺，甚至产生愈伤组织，表明激素浓度或温度过高。得到脱毒无性系，即可继代繁殖。或低温保存。无毒种苗繁殖为了生产需要，获得无毒种苗应在大田进行扩繁。因为脱毒苗并不具备额外抗病能力，即在大田生长中有可能重新感病。无虫网室扩繁种苗（马铃薯）。选择隔离区，无病原地带。