BD-Accuri-C6用户指南

科学已很复杂，流式要更简单！用户指南1.CFlow软件介绍你可以通过AccuriCFlow或者CFlowPlus软件控制C6流式细胞仪，实现数据获取，生成统计数据以及分析结果等操作。CFlow功能强大，而且简单易用。CFlow软件具有以下特性：
有收集，分析，统计三个查看面板。
Plots可以显示超过106的数据动态范围。
可以随时进行数据分析和补偿调节。
可以拖拉plots。
以FCS3.0格式输出文件。
C6格式数据可以准确无误的转换为FCS格式数据。1.1安装CFlow这样安装CFlow:1.确保没有用USB连接计算机和C6流式细胞仪。2.打开计算机和显示器。3.插入CFlow软件CD光盘或者Accuri提供的U盘，当准备完毕，双击CFlowInstaller.exe文件。4.按照安装向导的提示进行安装。1.2启动CFlow先安装并设定好C6流式细胞仪，再运行CFlow软件（请参考C6FlowCytometer安装手册）。这样打开CFlow软件：1.双击计算机桌面上的CFlow图标，CFlow会打开一个新的空白的工作面板。注意：如果CFlow显示信息Extrastartuptimeneededduetocleaningorimpropershutdown,C6会比平时多用几分钟完成恢复，然后回到绿灯准备完毕状态。当对仪器进行首次安装时，你可能会遇到这种情况。如果不小心关闭仪器电源，也会出现这种情况。1.3CFlow工作面板（Workspace）CFlow的主工作窗口叫做CFlowWorkspace，这个工作面板包含获取和分析数据所需的所有控制以及显示功能面板。CFlow工作面板分为三个控制面板：
收集面板（Collect）—包括设定数据收集以及数据获取条件的控制命令（第3章有详细说明）。
分析面板（Analyze）—包含数据分析的控制命令（第4章有详细说明）。
统计面板（Statistics）—显示统计学信息（第5章有详细说明）1.4打开一个新的CFlow工作面板当打开CFlow，会显示一个不带任何用户设置的空白工作面板，你可以使用这个新的工作面板来建立自己的分析模板。这样打开新的工作面板：1.做下列操作之一：
如果CFlow还没打开，双击计算机桌面上的CFlow图标。
如果CFlow已经打开了，选择FileNewCFlowFile。CFlow会提示你保存对之前工作模板所做的任何未保存的改动。1.5退出CFlow这样退出CFlow：1.选择FileQuit2.如果被提示保存对CFlow工作模板所做的改动，做下列操作之一：
点击Yes按键保存改动。
点击No按键关闭CFlow，不做改动。
点击Cancel按键，取消操作，保持CFlow软件打开状态。1.6使用CFlow示例文件你可以从Accuri网站上（）下载一个对人外周血进行4色分析的CFlow示例文件（HPB4ColorTutorial.c6）。你可以使用此文件数据来熟悉CFlow的各个操作工具，而不用担心破坏或者丢失自己的实验数据。本用户指南中所展示的图片，都是来自于对这个示例文件数据的分析。这样生成示例文件：使用四管样本来进行CD3+CD4+以及CD3+CD8+细胞群体分析。按照标准方法对这些外周血样本直接进行抗体标记，然后裂解红细胞。下面的表格描述了实验设计：
Tube1—背景对照。
Tube2—白细胞设门对照。
Tube3—确定CD45+CD3+亚群细胞内CD4+和CD8+细胞百分比的对照。
Tube4—样本。表1-1.人外周血4色分析示例的实验设计此实验设计不包含单染荧光对照，唯一可能存在荧光溢出导致设门不准的情况来自FITC通到漏到PE通道，以及PE-Cy7通道漏到FITC和PE通道。关于调节荧光补偿的细节，请看3.12章节。2.校准C6性能当使用C6时，每天至少保证校准一次液流，这样可以确保在进行实验样本检测时C6工作状态正常。每天使用同样的CFlow文件来收集校准小球的数据，这样你就可以比较机器状态随时间的变化。当运行校准程序时，将下一行空样本孔的A-D设为8-Peak小球检测孔，将空样本孔的E-H设定为6-Peak小球检测孔。在命名时，将日期包含在样本名字中，这样你就可以追踪每日机器状态。当样本孔设定满之后，再打开一个新的校准文件继续。需要的试剂：
8-peak校准小球（AccuriPart#QA-100，随C6仪器一起到货）。
6-peak校准小球（AccuriPart#QA-110，随C6仪器一起到货）。
鞘液：过滤去离子水（0.2μm滤膜），BacteriostaticConcentrationSolution（8-peak校准小球（AccuriPart#KR-220，随C6仪器一起到货）2.1运行校准小球这样运行校准小球：设定：1.如果这是第一次运行C6，打开一个CFlow文件，在上样针处放一管过滤去离子水，运行至少15分钟。2.确认被命名为CFlow8&6PeakBeadTemplate.c6t的文件已被拷贝到CFlow计算机上，这个文件位于CFlowCD或者U盘上，也可以从Accuri网站上获取：选择FileOpenCFlowFileorTemplate。4.在打开的对话框中，找到并打开模板文件。图2-1.打开模板BeadTemplate。清洗上样针：5.点击A-D行的第一个空样本孔。图2-2.选择空样本孔。6.在上样针处放置一个空的12x75mm的管子。7.点击Backflush按键。8.Backflush结束后，在上样针处放一个装有2mL过滤去离子水的新管子。9.在仪器控制面板取消RunUnlimited选项。图2-3.运行限制：取消RunUnlimited10.在仪器控制面板中，激活Min和Sec选项旁边的时间确认框，设定运行时间为2分钟。11.在控制面板的液流控制区选择高速（Fast）。12.点击RUN按键，冲洗上样针。13.当运行结束，点击DeleteSampleData按键，删除在清洗上样针时收集的数据。14.从上样针移去管子。运行8-peakValidationBeads：15.取消Min和Sec选项旁边的时间确认框，激活事件确认框，设定当收集特定数目的事件时停止运行。16.在Events编辑框中，输入50000，从下拉菜单中选择UngatedSample。图2-4.运行限制：50000事件。17.振荡混匀样本管中按说明配制好的8-peak校准小球悬液，放在上样针处。18.在控制面板的液流版块选择Slow按键。19.点击RUN按键开始获取数据，当获取事件总数达到50000时会自动停止获取。注意：确认开始运行之前，CFlow中选择的是空样本孔，如果按键显示的是ADDTO，这个孔已经包含数据。提示：在FSC-Hvs.SSC-H散点图中，可能R1区域此时并没有包括主要小球群体，这很常见，在此阶段是允许的。20.在样本板上方的文本框内输入样本名称，将日期包含在样本名称中，以便区分不同日期获取的样本数据提示：你可以在收集样本前，收集样本时，或收集样本后进行命名。图2-5.样本名称：8-peakBeads。21.当数据收集结束，移去样本管，用无尘纸擦拭上样针末端，以最小化交叉污染。运行6-peakValidationBeads：22.振荡混匀样本管中按说明配制好的6-peak校准小球悬液，放在上样针处。23.点击E-H行的第一个空样本孔。图2-6.选择空样本孔。24.确认Events依然是在UngatedSample中收集50000。图2-7.运行限制：50000事件。25.点击RUN按键。提示：在FSC-Hvs.SSC-H散点图中，可能R2区域此时并没有包括主要小球群体，这很常见，在此阶段是允许的。26.为样本命名，将日期包含在名称中。图2-8.样本名称：6-peakBeads。结束数据收集：27.当数据收集结束，移去样本管，用无尘纸擦拭上样针末端。28.在上样针处放一管2mL过滤去离子水，点击一个空样本孔。29.在仪器控制面板中选择时间确认框（MinSec），设定时间为2分钟。图2-9.运行限制：2分钟。2.2保存校准小球数据通过默认设置，CFlow会在每个样本收集完毕时自动保存校准小球数据。你也可以随时手动保存数据，请看3.10章节关于保存数据的介绍信息。2.3分析并记录校准小球数据当收集完小球数据后，使用CFlow的Collect面板进行数据分析，这样可以确保C6运行正常。这样分析小球数据：1.点击包含最新8-peak小球数据的样本孔（在A-D行）。2.在小球文件的第一个FSC-Hvs.SSC-H散点图中，通过拉拽调整预先画的R1门的位置圈住主要小球群体（看图2-10）。R1应该包括所有事件的75-85%。注意：通常会有一个“阴影”群体（被称为粘连小球或者小球团块），比主要小球群体的FSC-H值略大一些；这是常见情况，R1中不要包括阴影群体。粘连小球图2-10粘连小球显示图。3.确认后三张图（FL1-H,FL2-H以及FL3-H）被gate到R1门中，在图上GATE按键旁会显示R1inall信息。如果没有出现这样的显示，点击GATE按键，从弹出的菜单中选择R1inallevents。关于门的信息，请看3.6章节。图2-11.应用于8-PeakBeadPlot的门。4.测定每个荧光图中top峰（最亮的，最远的）的CV值，将预先画好的水平marker紧绕在峰周围。
使用Zoom工具来放大top峰（看3.9章节）。
通过点击并拉拽水平marker的边缘，调整marker位置使它紧绕峰周围。
点击Expand工具回复到原来的大小。5.将运行小球得到的数据与随C6仪器一起运到的出厂数据进行比较，如果C6运转正常，数据图应该与图2-13中的8-peakbead图看起来相似。检查下列信息：
在FSC-HvsSSC-H上图中有主要的小球群体（有一个阴影群体是可接受的）。
在FL1-H在和FL2-H图中有8个清晰可辨的峰。
在FL3-H图中有至少6个峰。注意：FL4-H的表现通过步骤6-9的6-peakbeads图检测。图2-13.8-peak校准小球数据6.选择包含最新6-peak小球数据的样本孔（在E-H行）。7.调整预先画好的R2门在6-peak小球FSC-Hvs.SSC-H散点图中的位置，圈住主要小球群体（与8-peak小球操作程序类似）。这个群体应该看起来像个感叹号，R2门应该包含整个感叹号群体（图2-14）。图2-14.6-peak校准小球数据8.确认FL4-H图被gate到R2门中。如果没有，点击GATE按键，从弹出的菜单中选择R2inallevents。9.通过调整FL4-H图中Marker的位置，使其紧绕top峰（最亮的，最远的），测定CV值。可以参考图2-14中关于好的6-peak小球数据的例子，检查下列信息：
在FSC-HvsSSC-H上图中有主要的小球群体。
在FL4-H图中有6个峰。10.如果你想，可以在AccuriC6流式细胞仪日志中（在CFlowCD或者U盘中可以找到）记录下每个参数的下列信息：
峰的数目。
Top峰的平均道数和FSC值。
Top峰的CV值和FSC值。2.4监测校准小球数据你可以在一个CFlow文件中轻松监测校准小球数据（以及C6运行性能）随时间的变化，从而轻松判定C6运行状态是否稳定。这样监测小球数据：1.在独立的样本空中保存每日获取的8-和6-peak校准小球数据。2.在Statistics面板建立一个统计表格，包含Top峰的平均道数和CV值，以及FSC等信息（看第5章关于在Statistics面板建立统计表格的详细信息）。C6报告算术平均数。图2-15Statistics面板：来自连日记录的8-peak小球数据。3.比较统计数据随时间的变化，根据趋势