抗肿瘤药物阿霉素对细胞增殖及凋亡的影响

抗肿瘤药物阿霉素对细胞增殖及凋亡的影响冯景（201111201028）张书（201111201036）指导老师：张伟摘要：为了探究抗肿瘤药物阿霉素对细胞增殖及凋亡的影响，使用了MTT比色法测定了细胞给不同浓度后的相对数量，研究其对细胞增殖的影响；使用荧光染色法研究其对细胞形态的影响，并观察细胞凋亡形态。关键字：阿霉素细胞凋亡MTTAbstract：Toexploretheanticancerdrugdoxorubicineffectoncellproliferationandapoptosis,studyingitseffectsoncellproliferationbytheMTTthatanalyzestherelativenumberofcellsafterdifferentconcentrations;learningitsaffectoncellsmorphologyusingfluorescencestainingandapoptoticmorphologywasobserved.Keywords:ApoptosisdoxorubicinMTT近50年的抗肿瘤药物研究开发工作使肿瘤化疗取得相当的进步，特别是使血液系统恶性肿瘤患者生存时间明显延长，但严重威胁人类生命健康的占恶性肿瘤90%以上的实体瘤的治疗尚未达到满意的疗效。抗肿瘤药物正从传统的非选择性单一的细胞毒性药物向针对机制的多环节作用的新型抗肿瘤药物发展。目前发现许多天然药物具有抗肿瘤作用，部分常用的抗肿瘤药物及其作用机制如表1所示，其中很多抗肿瘤药物可以明显抑制肿瘤细胞的增殖，而对正常细胞的毒副作用较小。表1.部分常用的抗肿瘤药物及其作用机制药物名称作用机制药物名称作用机制ActinomycinD（更生霉素）抑制RNA的合成Glucocorticoids（糖皮质激素）激素Adriamycin（Doxorubicin，阿霉素）DNA嵌入剂5-Fluorouracil（5-氟尿嘧啶）抗代谢药物Bleomycin(博来霉素)引起DNA片断化Hydroxyurea（羟基脲）抗代谢药物Camptothecin（喜树碱）拓扑异构酶I型药物Mitoxantrone（米托蒽醌）DNA嵌入剂Chlorambucil（苯丁酸氮芥）DNA交联剂Paclitaxel(TAXOL)(紫杉醇)靶向微管药物Cisplatin（顺铂）DNA交联剂Staurosporine（星形孢菌素）激酶抑制剂Cytarabine（阿糖胞苷）抗代谢药物Tamoxifen（它莫西芬）激素拮抗剂Cycloheximide(放线菌酮)蛋白质合成抑制剂Topotecan（拓扑替康）拓扑异构酶I型药物Cyclophosphamide（环磷酰胺）DNA交联剂Vinblastine（长春碱）靶向微管药物材料和方法1实验材料1.1生物材料人胃癌细胞BGC-8231.2试剂MTT母液(5mg/mL)、裂解液（10%SDS—0.01NHCl）、胰酶、PBS溶液、PI、Ho.33342、阿霉素。阿霉素：是一种抗肿瘤抗生素，可抑制RNA和DNA的合成，对RNA的抑制作用最强，抗瘤谱较广，对多种肿瘤均有作用，属周期非特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用。主要适用于急性白血病，对急性淋巴细胞白血病及粒细胞白血病均有效，一般作为第二线药物，即在首选药物耐药时可考虑应用此药。PI（碘化丙啶）：是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测，它是一种溴化乙啶的类似物，在嵌入双链DNA后释放红色荧光。尽管PI不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。Ho.33342：结合于DNA的AT碱基对，释放蓝色荧光,可进入活细胞,用于细胞周期的研究,染色体和细胞核的观察2实验方法步骤2.1取对数生长期的细胞,用胰酶消化计数,配制细胞悬液浓度为:3-4×104/mL，取细胞接种到96孔板，每孔200μL，即8000细胞/孔。2.2加药处理:待细胞贴壁后于第二天中午换液加药(可在24小时进行),换200μL新鲜培养基，用无菌水配制相应浓度的药液（详细配置药液方法见表2），每个孔加入4μL配制后药液，作用72小时。表2.阿霉素浓度配制表1246810阿霉素ul0.40.81.62.43.24无菌水ul39.639.238.437.636.836总体积ul404040404040图1.96孔板加样示意图2.3测定:取测定孔,弃去培养基,加100μL新鲜的培养基,加12μLMTT，8小时后加100μL裂解液。过夜后，用酶标仪测定OD值。2.4将酶标仪测出的数据用SPSS软件进行分析，找出半数抑制浓度(IC50)，IC50是指在用药后存活的细胞数量减少一半时所需的药物浓度。在MTT法中,就是以对照组吸光度OD值减少一半所需的药物浓度为IC50。2.5取生长到80-90%融汇度，对数生长期的细胞，按1：4比例传代。取1瓶细胞传到4瓶。2.6第二天加入药物或水。本组实验加入4μg/ml的药物培养基。2.748小时后，收集培养液，用胰酶适度消化细胞，用收集的培养液吹打细胞，将分散成单个的细胞悬液收集至10mL离心管中，1000rpm,离心15min去上清，用0.2毫升PBS重悬细胞。2.8取178μlPBS细胞悬液，加入PI20μL（终浓度100μg/ml），Ho.333422μL（终浓度10μg/ml），混匀，37度温箱中避光标记15min。(带手套操作）2.91000rpm，离心10min，弃上清，加30μLPBS重悬，取10μL滴于载玻片上，盖片（不能有气泡或漂起），保存于暗处。2.10荧光显微镜观察拍照（紫外激发）。实验结果1MTT实验结果表3各药物浓度梯度对应的OD值序号0124681011.6781.2071.2650.4140.388-0.148-0.26321.6021.5091.1530.3240.301-0.146-0.331.5861.5311.1970.3660.094-0.107-0.22841.6531.5391.250.4190.66-0.142-0.275均值1.629751.44651.216250.380750.36075-0.13575-0.2665抑制率0.112440.253720.766380.7786511表4SPSS软件求得的IC50（红框所示）图2各药物浓度梯度对应的抑制率及其拟合直线根据图二可以看出，药物浓度越大，对细胞抑制效果越强，又因R2=0.941，拟合效果较好。根据表四得：ic50=3.21μg/ml。综合其他组的实验结果和助教的预实验，认为3.21μg/ml可能抑制效果不够明显，不利于拍到凋亡细胞形态，最终取4μg/ml继续做后面的药物对核型影响的实验。2荧光染色结果图3阿霉素对照组细胞核荧光染色照片图4阿霉素（4μg/ml)细胞核荧光染色照片对照组细胞细胞核正常，呈规则的圆形，细胞整体呈蓝色，几乎没有凋亡细胞，属于正常细胞，由于操作问题，有少量呈紫红色坏死细胞。实验组除了有正常的细胞外，还有一些细胞细胞核呈现肾形或坍缩状等不规则形状，有凋亡小体(白色箭头所示)形成，属于凋亡细胞，此外，还有大量坏死（白圈所示）细胞，细胞呈红色或紫红色。结果表明阿霉素对于BG-823细胞的凋亡具有促进作用。讨论1实验整体系统误差分析受到实验条件的限制，铺板后加药前之间的时间（12h），以及阿霉素诱导的时间（72h）均与依据文献不同，不知对实验结果的影响。2实验随机误差分析实验随机误差主要是和操作人员有关，由于加MTT和染料需要避光，加药时可能每孔的加药量不一致甚至有些孔加错，导致有些数据不正常。舍弃一些误差太大的数后，本次实验每个药物浓度下基本有4个平行，数据还可用作分析。