PCR and Primer Design

PCRandPrimerDesignPCRandPrimerDesignAcknowledgement:SomeoftheslidesaremodifiedfromalecturegivenbyLiLiu,M.D.InterdisciplinaryCenterforBiotechnologyResearchUniversityofFloridaJune10,2003生物秀—专心做生物【】易生物—实验室问题解决伙伴【】生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区生物秀—专心做生物【】易生物—实验室问题解决伙伴【】生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区生物秀—专心做生物【】易生物—实验室问题解决伙伴【】生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区生物秀—专心做生物【】易生物—实验室问题解决伙伴【】生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区生物秀—专心做生物【】易生物—实验室问题解决伙伴【】生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区)EstimatethenumberofsequencesthatA)Estimatethenumberofsequencesthathaveunwantedhaveunwanted““tailstails””afterkcycles.afterkcycles.nnB)EstimatethetotalnumberofsequencesB)Estimatethetotalnumberofsequencesafterkcycles.afterkcycles.生物秀—专心做生物【】易生物—实验室问题解决伙伴【】生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区’’sCharacteristicsCharacteristicnnAmeltingtemperature(Tm)intherangeofAmeltingtemperature(Tm)intherangeof52Cto65C52Cto65CnnAbsenceofAbsenceofdimerizationdimerizationcapabilitycapabilitynnAbsenceofsignificanthairpinformationAbsenceofsignificanthairpinformation(3(3bpbp))nnLackofsecondaryprimingsitesLackofsecondaryprimingsitesnnLowspecificbindingatthe3'end(Lowspecificbindingatthe3'end(ieie.lower.lowerGCcontenttoavoidGCcontenttoavoidmisprimingmispriming))生物秀—专心做生物【】易生物—实验室问题解决伙伴【】生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区(BLASTsearchagainstcorrespondinggenome)Primercandidate15’-TGCTAAGTTG-3’Primercandidate25’-CAGTCAACTGCTAC-3’TGCTAAGTTGCAGTCAACTGCTACTemplateDNA5’...TCAACTTAGCATGATCGGGTA...GTAGCAGTTGACTGTACAACTCAGCAA...3’NOTUNIQUE!UNIQUE!TGCTAGTTGA生物秀—专心做生物【】易生物—实验室问题解决伙伴【】生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区’sunique;thelongertheprimer,thehighermelting/annealingtemperature.Generallyspeaking,thelengthofprimerhastobeatleast15basestoensureuniqueness.Usually,wepickprimersof17-28baseslong.Thisrangevariesbasedonifyoucanfinduniqueprimerswithappropriateannealingtemperaturewithinthisrange.生物秀—专心做生物【】易生物—实验室问题解决伙伴【】生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区•Randombasecompositionispreferred.Weshallavoidlong(A+T)and(G+C)richregionifpossible.•Usually,average(G+C)contentaround50-60%willgiveustherightmelting/annealingtemperatureforordinaryPCRreactions,andwillgiveappropriatehybridizationstability.However,melting/annealingtemperatureandhybridizationstabilityareaffectedbyotherfactors,whichwe’lldiscusslater.Therefore,(G+C)contentisallowedtochange.TemplateDNA5’...TCAACTTAGCATGATCGGGCA...AAGATGCACGGGCCTGTACACAA...3’TGCCCGGCCCGATCATGCTGCCCGGCCCGCATTTATGC生物秀—专心做生物【】易生物—实验室问题解决伙伴【】生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区–thetemperatureatwhichhalftheDNAstrandsaresinglestrandedandhalfaredouble-stranded..TmischaracteristicsoftheDNAcomposition;HigherG+CcontentDNAhasahigherTmduetomoreHbonds.CalculationShorterthan13:Tm=(wA+xT)*2+(yG+zC)*4Longerthan13:Tm=64.9+41*(yG+zC-16.4)/(wA+xT+yG+zC)(Formulaearefrom)生物秀—专心做生物【】易生物—实验室问题解决伙伴【】生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区=Tm_primer–4°CAnnealingTemperature,Tanneal–thetemperatureatwhichprimersannealtothetemplateDNA.ItcanbecalculatedfromTm.生物秀—专心做生物【】易生物—实验室问题解决伙伴【】生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区°structuresareharmlesswhentheannealingtemperaturedoesnotallowthemtotakeform.Forexample,somedimersorhairpinsformat30°CwhileduringPCRcycle,thelowesttemperatureonlydropsto60°C.生物秀—专心做生物【】易生物—实验室问题解决伙伴【】生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区–forwardprimerandreverseprimer.SincetheyareusedinthesamePCRreaction,itshallbeensuredthatthePCRconditionissuitableforbothofthem.Onecriticalfeatureistheirannealingtemperatures,whichshallbecompatiblewitheachother.Themaximumdifferenceallowedis3°C.TheclosertheirTannealare,thebetter.生物秀—专心做生物【】易生物—实验室问题解决伙伴【】生物秀论坛——学术交流、资源共享、互助社区~whenisaSummary~whenisa““primerprimer””aaprimer?primer?5’3’5