细胞生物学的研究技术和方法

细胞生物学的研究技术和方法本章内容提要一、细胞生物学概念二、细胞生物学与医学三、细胞生物学发展简史一、细胞生物学（cellbiology）利用现代物理、化学技术和分子生物学方法，从细胞整体、亚显微结构、分子水平来研究细胞生命活动基本规律的科学。研究对象：细胞细胞（cell）是由膜包围着含有细胞核(或拟核)的原生质所组成是生物体结构和功能的基本单位是生命活动的基本单元?研究内容：细胞各组分：膜、质、器、核等结构和功能以及相互关系。细胞整体和动态的功能活动：发育、分裂、分化、遗传、变异、衰老、死亡等及其调控。研究任务：通过对细胞各组分、细胞整体和动态的功能活动的研究，阐明细胞各种生命活动的本质和规律。进一步利用和控制细胞活动的现象和规律，达到造福于人类的目的。为什么要从三个层次来研究细胞？为什么要把细胞单独作为一门学科进行研究？细胞内具有高度有序且为动态的结构体系：遗传信息结构体系膜结构体系细胞骨架结构体系分子复合物三大结构体系细胞生物体二、细胞生物学与医学（一）细胞生物学是现代医学的重要基础理论（二）现代医学重要课题的研究将依赖于细胞生物学的更深入的发展如肿瘤发生的机制、治疗（三）细胞生物学的研究成果应用于医学实践如干细胞的研究1996年7月5日，世界上第一只克隆羊“多利”在英国苏格兰卢斯林研究所（伊恩博士）的试验基地诞生。干细胞研究不仅为基础生物学研究开辟了新领域,还将为多种疾病的治疗新的思路和手段三、细胞生物学发展历史（一）萌芽阶段17世纪中叶—19世纪初叶1665年RobertHooke：CellcellMadebyA.vanLeeuwenhoek(1632-1723).Magnificationrangesat50-275x.1675年:原生动物、RBC、精子（二）细胞学说创立阶段19世纪初叶—19世纪中叶MatthiasJacobSchleidenTheodarSchwann细胞学说（celltheory）一切生物，从单细胞到高等动物和植物都是由细胞组成的，细胞是生物形态结构和功能活动的基本单位。（三）经典细胞学阶段19世纪中叶—20世纪初叶细胞核及其在分裂时的变化有丝分裂、减数分裂中心体、线粒体、高尔基复合体（四）实验细胞学阶段20世纪初叶—20世纪中叶形态生理功能、生物化学、遗传发育机理（细胞培养技术、电子显微镜）（五）细胞生物学阶段始于20世纪60年代细胞生物学今后的发展方向从细胞与分子的角度研究：基因的结构、表达与调控细胞内的信号转导细胞结构体系的组装细胞增殖、分化、凋亡的相互关系及其调控等。分子细胞生物学（molecularcellbiology）复习思考题1、根据细胞生物学研究的内容与你所掌握的知识，谈谈医学生学习细胞生物学的必要性，并举例说明细胞生物学与医学的密切关系2、细胞生物学是一门什么样的学科3、阐述细胞、细胞学说的内容第二章细胞生物学的研究技术和方法本章内容提要一、形态结构研究：显微结构、亚微结构二、细胞组分的测定及分离：细胞化学技术、放射自显影技术、细胞组分的分级分离三、其他实验技术：细胞培养技术、细胞融合技术、细胞原位分子杂交技术一、形态结构观察（一）显微结构（microscopicstructure）——光镜下所见的细胞结构1、普通光镜分辨力—显微镜或人眼在25cm的明视距离处能够区分相近两点间最小距离的能力。人肉眼分辨力：100μm光镜最大分辨力：0.2μm人卵细胞2、相差显微镜观察活细胞（倒置相差显微镜）观察活细胞内细胞器以及液体介质中的细菌和真菌等特点:反差大、分辨力高（0.04μm),但不能分辨内部微细结构3、暗视野显微镜4、荧光显微镜对细胞中的荧光物质进行定性、定位观察（可检测蛋白质、核酸）。光源—紫外线自发荧光:VitA、核黄素、叶绿素等诱发荧光:丫啶橙DNA黄色RNA绿色罗达明—蛋白质蓝色荧光示DNA；绿色荧光示微管（二）细胞的亚微结构亚微结构（submicroscopicstructure）——指细胞内小于0.2μm的微细结构1、透射电子显微镜（TEM）观察细胞内部细微结构特点：平面图象分辨力：0.08nm2、扫描电子显微镜（SEM）观察样品（细胞）表面形貌特点：立体图象分辨力：3nmFigure3-32.Cellsinculture.Scanningelectronmicrographofratfibroblastsgrowingontheplasticsurfaceofatissue-culturedish.3、高压电子显微镜（HEM）电镜电子束加速电压：120KV以下—常规EM120KV以上—高压EM500KV以上—超高压EM特点：分辨力高，可观察厚切片（1μm）二、细胞组分的测定（P27）及分离（一）测定1、细胞化学技术保持细胞完整结构的基础上，利用某些化学物质可与细胞内某种成分发生化学反应，在局部范围内形成有色沉淀（或电子密度高的物质）的原理，对细胞的化学成分进行定性、定位和定量的研究。可对蛋白质（酶）、核酸、碳水化合物等进行定性、定位、定量研究。2、荧光细胞化学技术原理：用荧光色素对细胞进行染色，在荧光显微镜下观察细胞中的荧光现象（研究对象同上，但特异性比一般细胞化学技术强，灵敏度高）。3、放射自显影技术通过跟踪被放射性同位素标记的生物大分子或其前体物质的代谢过程，在不破坏组织和细胞结构的情况下，研究机体和细胞代谢状态和动态变化的过程。能揭示细胞分子水平的动态变化。放射性同位素（3H、32P、125I等）↓标记生物分子或其前体物质↓引入细胞或机体中↓取组织制片↓感光↓分析胸腺嘧啶核苷酸3H（二）细胞组分的分离（P23）包括细胞各种结构和各化学组分的分离。细胞分级分离法——细胞各种结构的分离组织细胞匀浆分级分离分析1、组织细胞匀浆—机械性研磨细胞2、分级分离根据细胞内各种结构的比重和大小不同，而致在同一离心场内沉降速度也不相同的原理。①差速离心②密度梯度离心差速离心3、分析—用细胞化学法等鉴定得到的组分密度梯度离心三、其它实验技术（一）细胞培养技术P21细胞培养：在无菌条件下，从活体中取出的细胞或其它建系细胞，在模拟体内正常生理环境情况下，使之能继续生存、生长、增殖的一种方法。原代培养：传代培养：当原代培养的细胞生长、增殖达到一定密度后，从一个培养器以一定比例分装或转移到另一个或两个以上容器中所进行的再次培养（传一次称为一代）。指直接从肌体获取组织或细胞后立即进行的首次细胞培养。细胞培养技术是细胞生物学中最基本、最常用的一项实验技术，细胞大量生理、生化数据以及功能活动资料大多由它而获得。（a)：Hela细胞（b)：中国地鼠卵巢细胞（二）细胞融合技术细胞融合:指细胞彼此接触时，两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的现象。细胞融合的结果：含两个不同亲本细胞核的细胞含同一亲本细胞核的细胞异核体同核体自然融合人工诱导融合（生物、物理、化学）细胞融合技术是研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤等的重要手段，尤其对单克隆抗体的产生开拓了一条新的途径。单克隆抗体技术B淋巴细胞能分泌特异抗体，但不能长期培养，瘤细胞可以在体外长期培养，但不分泌特异抗体。于是Kohler和Milstein1975将两种细胞杂交而创立了单克隆抗体技术，获1984年诺贝尔奖。HAT:hypoxanthine，aminopterin，thymidine（三）核酸分子杂交技术P32利用碱基互补原则使两条核酸单链形成双链杂交分子，该过程称核酸分子杂交。应用此原理检查两种核酸分子碱基排列的互补程度称核酸分子杂交技术。细胞原位分子杂交技术：使细胞中DNA或RNA在保持原来位置条件下进行的分子杂交。可对所用材料中被杂交的DNA分子进行定位、定量分析以及基因表达水平的观察。复习思考题1、总结已学习过的各种显微镜的主要用途2、细胞化学法的原理及应用3、怎样获取细胞的不同组分4、两个不同亲本的细胞融合后可能得到哪两种类型的细胞5、电镜下我们是怎样认识细胞结构的