85分子生物学学习指南汇总

1/54Introduction一、分子生物学的概念广义：分子生物学是一门在分子水平上研究生命现象、阐明生命本质的学科。狭义：分子生物学是研究核酸、蛋白质等生物大分子的结构与功能，并从分子水平上阐述核酸与蛋白质、蛋白质与蛋白质之间相互作用的关系的学科。二、分子生物学的发展简史历届诺贝尔生理、医学、化学奖，及分子生物学发展的里程碑事件。三、分子生物学的研究内容1、生物大分子结构与功能2、基因的表达调控3、细胞信号转导4、DNA重组技术四、分子生物学的发展趋势1、功能基因组学研究2、转录组学研究3、蛋白质组学研究4、代谢组学研究5、生物信息学研究问答题：1.2012诺贝尔的医学与化学奖分别授予了多能干细胞以及G蛋白偶联受体工作，就你目前所学的扩展知识对其中一种进行论述。2.分子生物学主要研究哪4个方面？SectionC：核酸的性质本章基本内容重点、难点：核酸的结构、性质一、核酸结构核酸是由核糖、碱基（嘌呤和嘧啶）、磷酸构成。碱基与核糖构成核苷，核苷与磷酸形成5’-核苷酸。碱基是含有N原子的嘌呤或嘧啶的衍生物。核酸有两类：⑴DNA（脱氧核糖核酸）：由脱氧核糖、碱基（A、G、C、T）、磷酸形成的5’-脱氧核苷酸构成。⑵RNA（核糖核酸）：由核糖、碱基（A、G、C、U）、磷酸形成的5’-核苷酸构成。自然界的核苷酸多为核苷-5’-磷酸。核苷酸有核苷单磷酸、核苷二磷酸和核苷三磷酸，分别用NMP（rNMP）、NDP（rNDP）和NTP（rNTP）表示；脱氧核苷单磷酸、脱氧核苷二磷酸和脱氧核苷三磷酸分别用dNMP、dNDP、dNTP表示。在DNA和RNA分子中，核苷酸之间以3’，5’-磷酸二酯键连接形成长链大分子。核酸分子都有游离的5’端和游离3’端。核酸序列从左到右按5’端向3’端方向书写核酸的碱基序列，其中的核苷酸用单个碱基字母A、G、C、T或U代表。DNA双螺旋：2/541.1953年沃森和克里克提出两条DNA分子相互缠绕形成右手双螺旋，螺旋有大沟和小沟2.戊糖-磷酸骨架位于分子外侧，双链间对应碱基靠氢键形成碱基对，其中A与T配对（2个氢键），G与C配对（3个氢键）。3.双螺旋的每一匝螺旋含约10个碱基对。两条链反向平行排列。双螺旋的两条链为互补链，任意一条链的序列可确定另条链的序列，它暗示出DNA复制和转录的分子机制。DNA二级结构：DNA二级结构主要是各种形式的螺旋，特别是B型双螺旋，此外还有A型双螺旋、Z型双螺旋和三链螺旋等。沃森和克里克提出的为B-DNA结构，是适用于所有DNA的稳定形式，碱基对与螺旋轴垂直，每匝10bp碱基对，有一条主沟和一条小沟。低温条件下，DNA可被诱导形成A型螺旋。A型与B型一样均为右手螺旋，但较宽而紧密，碱基对倾斜于螺旋轴，每匝为11个碱基对，A型的主要意义在于它是RNA及RNA与DNA杂合体的主要形式。在单一交替的嘧啶-嘌呤序列的合成双链DNA中，形成左旋Z-DNA，它有Z字型外观，每匝12碱基对，嘌呤核苷酸形成顺式构象。三链螺旋结构即H-DNA，它是DNA的非标准二级结构，其形成需要至少DNA的一条链全部由嘌呤核苷酸组成。DNA的三级结构为超螺旋，分为正超螺旋和负超螺旋，其中正超螺旋为左手超螺旋，因DNA双螺旋过度缠绕引起，负超螺旋为右手超螺旋，因DNA双螺旋缠绕不足引起。负超螺旋DNA很容易解链，故有利于DNA的复制、重组和转录。闭环DNA：大多DNA为闭环双链，两条链相互缠绕，缠绕的数目称为连接数（Lk)。分子中没有游离断。超螺旋是DNA双链轴线的高度卷曲，如果扭曲方向与双螺旋方向相同，为正超螺旋，反之为负超螺旋。几乎所有细胞中的DNA都是负超螺旋。超螺旋的水平可以用连接数的变化（△Lk）来衡量，如负超螺旋约6圈超螺旋/100圈双螺旋，表示为△Lk/Lk0=－0.06。拓扑异构体碱基顺序相同但连接数不同的DNA分子称为拓扑异构体。缠绕和扭曲缠绕(Tw)是指双螺旋一股链绕另一股旋转；扭曲(Wr)则是双螺旋轴在空间的盘绕。△Lk=△Tw+△Wr（参见教材P47）。嵌入剂如溴化乙锭能插到双螺旋的碱基对中，使之解旋。对负超螺旋分子，（负）扭曲减少，分子构型发生变化。超螺旋有扭转应力，比松散分子具有更高能量，对负超螺旋，这一能量有助于DNA螺旋的局部解旋。拓扑异构酶调控DNA超螺旋水平的酶称为拓扑异构酶。有两类：Ⅰ型在DNA一股链上产生一个切口，使另一条链得以穿越，连接数每次改变±1；Ⅱ型酶在双链上产生切口，使另一双链DNA片段得以穿过，连接数每次改变±2。对所有的生物体，拓扑异构酶都是一种必要的酶，涉及复制重组和转录。RNA二级结构RNA通常为单链，可以通过分子内氢键形成局部螺旋结构，最常见的是茎环（发夹）结构。tRNA的二级结构像三叶草，含有四个茎和四个环，四个环分别是D环、反密码子环、可变环和TψC环。四个茎依次是受体茎、D茎、反密码子茎和TψC茎。RNA的三级结构主要有假节结构、“吻式”发夹结构和发夹环突触结构等。tRNA的三级结构是倒L型结构。DNA的特殊结构连续反向重复序列形成回文结构，不连续反向重复序列形成发夹或十字结构。DNA三链结构：DNA四链结构：二、核酸的性质核酸的性质包括酸碱解离、变性、复性、紫外吸收和水解。氢键碱基堆积力和疏水作用维持核酸的稳定性。但在强酸条件下，核酸完全水解为碱基、核糖及磷酸，在略稀的酸中则产生脱嘌呤核酸。DNA化学测序法是用化学方法移去特定碱基或将DNA在特定碱3/54基处断裂。碱性环境中嘌呤产生由酮式向烯醇式转化，导致氢键断裂，双链解离，DNA变性。一些化学物质能使核酸在中性PH下变性，如尿素和甲酰胺。DNA为细长分子，水溶液具有高黏性，机械力或超声波易损伤DNA，使其黏度下降。将DNA放入高浓度高分子盐溶液（如氯化铯）中高速离心，DNA最终沉降于与其浮力密度相应的位置，形成狭带，这种技术称为平衡密度梯度离心或等密度梯度离心。DNA的沉降可用来确定其（G+C）含量和分离具有不同（G+C）含量的片段。紫外光吸收和减色性DNA和RNA最大紫外光吸收波长为260nm，与蛋白质的280nm相区别，用于核酸定性定量和纯化。单核苷酸光吸收值最大，其次是单链DNA（ssDNA)，双链DNA(dsDNA)最小，这种变化称为减色性。DNA纯度dsDNA的大致纯度可由A260/A280的比值来确定，纯dsDNA该值为1.8，纯RNA为2.0，蛋白质则小于1，如果DNA样品的A260/A280大于1.8，说明有RNA污染，小于1.8，说明含有蛋白质。变性和复性加热使DNA中氢键断裂，双链DNA的螺旋结构变成不规则的线团，称为DNA变性。变性核酸的紫外光吸收值增大，其变化值一半时对应的温度称为解链温度（Tm)，它随DNA中G+C含量的增加而增大。退火处理（慢速冷却）使得互补链互相配对，恢复双链结构为DNA复性。不同核酸链互补部分的复性称为杂交。影响Tm值的因素：Tm=81.5+0.41(%G+C)+16.6logM-0.62(%formamide)-500/length（GC含量，M=molarconcentrationofmonovalentcation(likeMg++)单价阳离子浓度，甲酰胺（formamide）浓度，片段长度）PCR：利用与DNA模板两端互补的一对引物来扩增一段DNA的过程为聚合酶链反应（PCR）PCR循环：目的DNA加热至950C变性分为两条链，当降温至550C，引物与模板退火，再升温至720C进行聚合反应（消耗dNTP和Mg2+），对目标分子不断拷贝，直至温度再次升到950C，变性、退火、聚合不断循环，使分子数目迅速增长。通常循环20~40次已知一些序列信息从而能设计出引物的DNA都能应用于PCR。引物通常为18~30个核苷酸，如果克隆一个只知道部分氨基酸序列的蛋白质的cDNA，可利用遗传密码的简并性设计简并引物，这种应用简并寡核苷酸引物的PCR有时也叫DOP-PCR；从嗜热菌中分离的热稳定的DNA聚合酶被用于PCR，常用Taq聚合酶。PCR还有一些派生技术。如RT-PCR,nested-PCR，real-timePCR等。引物设计的原则：1、引物长度：15-30bp，常用为20mer左右，引物的有效长度不能大于38mer，否则最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度（74℃），不能保证PCR扩增产物的特异性2、引物扩增跨度：以100-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段3、引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带，ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列4、避免引物内部出现二级结构避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异性的扩增条带5、引物3’端的碱基要求严格配对，特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败6、引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。7、引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性8、引物量：每条引物的浓度0.1~1umol或10~100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。4/54Real-timePCR的原理：通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。1.PCR过程中，探针与模板的特定序列结合，DNA聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性，将探针水解，从而破坏荧光基团和淬灭基团之间的FRET，照射报告基团发出可检测的荧光信号，4.随着PCR扩增的进行，荧光信号不断积累。SectionD原核及真核染色体结构（fromgenetogenome）本章基本内容重点、难点：染色体的结构，基因组的复杂度一、原核生物的染色体结构原核生物的基因组可以大肠杆菌染色体为例，其为单一闭环DNA分子，集中分布在拟核区域内。生长时，DNA持续复制，生长速率最大时，每个细胞平价有基因组的两个拷贝。DNA有50-100个环或结构域，各个结构域可保持不同水平的超螺旋，整个染色体为负超螺旋。结构域被非特异结合蛋白如HU和H-NS等类组蛋白缠绕，使一半超螺旋被束缚。RNA聚合酶及mRNA等有助于类核的组构。尚未发现核小体染色质真核生物DNA总长度比原核生物大数千倍，并由一定数目分散的染色体组成，每条染色体中的DNA为单一线性分子。染色质是紧密组装高度有序的DNA-蛋白质复合体。组蛋白是染色质中主要的结合蛋白，分5类：H2A、H2B、H3、H4，以及H1。所有组蛋白带有大量正电荷，序列中20%-30%由精氨酸和赖氨酸组成，这样组蛋白与带负电的DNA紧密结合。H1在不同种间在序列上比其他组蛋白具有更多的差异。核小体是染色质的基本构成单位。长约200bp，与由H2A、H2B、H3、H4各2分子构成的八聚体核心紧密结合有，以及1分子H1松散结合。除去H1，剩下与组蛋白八聚体结合的146bp的核小体核心。围绕核小体的DNA左手环绕形成负超螺旋（扭曲）。H1的功能H1与核小体结合，对DNA起稳定作用，免受核酸酶的降解。核小体核心与H1构成染色小体。在有些细胞中H1可被极度变异的组蛋白H5所取代。连接DNA核小体间由连接DNA串联，平均长度为55bp，不同组织中其长度在0-100bp内变化。30nm纤丝核小体进一步被组装成高度有序的左手螺旋（螺线管），即30nm纤丝，每圈螺旋约6个核小体。高级结构30nm纤丝构成100kb的环，被蛋白和核基质所固定。二、真核生物染色体结构有丝分裂染色体呈高度浓缩状态，两个姐妹染色单体在着丝粒处相连，染色体末端是端粒。酵母着丝粒仅由88bp长的富含AT的序列组成，而哺乳动物的着丝粒序列很长，其侧翼是大量的重复序列，即卫星DNA。端粒是染色体DNA末端特化的序列，由大量的短重复序列构成，由端粒酶合成。间期染色体在间期，染色体的基因被转录，DNA被