shiyan28植物组织中糖和淀粉含量的测定

82实验二十八植物组织中糖和淀粉含量的测定植物碳水化合物含量的测定，通常是先用80－85﹪乙醇提取，在此浓度的乙醇溶液中，还原糖和非还原糖（主要是蔗糖）溶解而淀粉沉淀，然后过滤，滤液用于测定可溶性糖（包括还原糖和蔗糖），残渣用于测定淀粉。还原糖可根据其还原能力大小直接测定其含量，蔗糖和淀粉先经水解生成还原糖，测其含量，然后换算成蔗糖和淀粉含量。本实验的目的在于掌握植物组织中可溶性糖和淀粉含量的测定原理和方法。Ⅰ、还原糖含量的测定（3,5－二硝基水杨酸法）一、目的掌握用3,5—二硝基水杨酸法测定植物组织中还原糖含量的原理和方法。二、原理3,5—二硝基水杨酸与还原糖共热后，被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，还原糖的量和反应液颜色深浅成比例关系，用分光光度法可测知样品的含糖量。该方法为半微量定糖法，操作简便，快速，较少受其他杂质干扰。三、材料、仪器设备及试剂1.材料：马铃薯；水果类及其他植物。2.仪器设备：分光光度计；电子分析天平；恒温水浴锅；试管；移液管；试管架；移液管架；研钵（或捣碎机）；洗耳球等。3.试剂及配制：3,5—二硝基水杨酸试剂（以下称DNS试剂）配制：A液—称取6.9g结晶的重蒸馏的酚于15.2ml10﹪氢氧化钠溶液中，并稀释至69ml，在此溶液中加入6.9g亚硫酸氢钠。此液为A液。B液—称取225g酒石酸钾钠，加入到300ml10﹪氢氧化钠溶液中，再加入880ml1﹪3.5—二硝基水杨酸溶液，此液为B液。将A液与B液相混合，即得黄色的DNS试剂，贮于棕色试剂瓶中。在室温下放置7—10d以后使用。1mg·ml－1葡萄糖标准母液配制：准确称取0.1g分析纯无水葡萄糖溶于蒸馏水中，溶解后定容至100ml。85﹪乙醇。四、实验步骤831.葡萄糖标准曲线制作1.1取7支25ml刻度试管，编号，按下表配制每管含量为0～1.2mg的葡萄糖标准液。试剂管号01234561mg·ml－1葡萄糖标准母液（ml）蒸馏水（ml）DNS试剂（ml）02.01.50.21.81.50.41.61.50.61.41.50.81.21.51.01.01.51.20.81.5每管葡萄糖含量（mg）00.20.40.60.81.01.2加入表中试剂后，摇匀，放入沸水浴中加热5min，立即取出用自来水冷却，然后向每管加入21.5ml蒸馏水，使总体积为25ml,摇匀后，以0号管为空白对照，在520nm波长处测定吸光度（A）值。1.2标准曲线绘制以1～6管葡萄糖含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。2.样品中还原糖的提取称取发芽马铃薯10g，磨碎（或捣碎），加入85﹪乙醇50ml，混匀，在50℃恒温水浴中保温30min（其间摇动数次），将上清液过滤到100ml容量瓶中，滤渣再用20ml85﹪乙醇二次提取，一并过滤到容量瓶中，最后用85﹪乙醇定容至刻度，摇匀备用。3.样品中还原糖含量的测定取4支25ml刻度试管，编号，其中3支（三个重复）分别加入样品糖分提取液1ml及蒸馏水1ml，1支空白管加2ml蒸馏水，然后各管再加入DNS试剂1.5ml，摇匀，混合液在沸水浴中加热5min，然后用自来水冷却，各加入21.5ml蒸馏水使总体积为25ml，摇匀，在520nm波长处测定吸光度（A）值。五、结果计算根据样品液所测得的吸光度值，从标准曲线查出其相应的还原糖含量，然后按下公式计算出样品中的还原糖百分含量。提取液总量（ml）从标准曲线上查得还原糖(mg)×———————————测定时提取液用量（ml）还原糖（﹪）=———————————————————————————×100样品重（mg）Ⅱ、蔗糖含量的测定一、目的掌握植物组织中蔗糖含量测定的原理和方法。84二、原理植物体内可溶性糖包括还原糖和非还原糖（主要是蔗糖）。因此测定蔗糖时，须先用盐酸将其水解为还原糖，再测定水解后的总还原糖含量，然后从总还原糖含量减去水解前还原糖含量即为蔗糖含量。三、材料、仪器设备及试剂1.材料：马铃薯、水果类及其他植物材料。2.仪器设备：分光光度计；电子分析天平；恒温水浴锅；25ml刻度试管；50ml容量瓶；100ml三角瓶；试管架；移液管；移液管架；洗耳球；玻棒等。3.试剂及配制6mol·L－1盐酸溶液；10﹪氢氧化钠溶液。1﹪酚酞指示剂配制：称取1g酚酞1g,用少量75﹪乙醇溶解后，加乙醇至100ml。四、实验步骤1.葡萄糖标准曲线制作与上述还原糖含量测定相同。2.样品中蔗糖的水解精确吸取上述测定还原糖含量的糖分提取液10ml置于100ml三角瓶中，加6mol·L－1盐酸10ml，摇匀，在沸水浴中加热10min，冷却后加入酚酞指示剂一滴，以10﹪氢氧化钠中和至溶液呈微红色，然后将提取液转入50ml容量瓶中加蒸馏水稀释定容至刻度，待测。3.样品中总还原糖的测定取4支25ml刻度试管，编号，其中3支（三个重复）分别加入待测液2ml,1支空白管加2ml蒸馏水，然后各管再加入DNS试剂1.5ml，摇匀，混合液在沸水浴中加热5min，然后用自来水冷却，各加入21.5ml蒸馏水使总体积为25ml，摇匀，在520nm波长处测定吸光度（A）值。五、结果计算根据待测液的吸光度值从上述标准曲线查中出其相应的还原糖含量，然后按下公式计算出样品中可溶性糖总量和蔗糖总量的百分率。10050从标准曲线上查得水解后还原糖(mg)×———×——102总还原糖含量（﹪）=————————————————————————×100样品重（mg）蔗糖含量（﹪）=（总还原糖含量－水解前还原糖含量）×0.95式中系数0.95依据于蔗糖水解时吸收了1分子水。85Ⅲ、淀粉含量的测定一、目的掌握植物组织中淀粉含量测定的原理和方法。二、原理淀粉用盐酸水解转化成葡萄糖后，测定葡萄糖含量，根据葡萄糖含量换算成淀粉含量。三、材料、仪器设备及试剂材料、仪器设备及试剂与上述蔗糖的测定相同，另增加碘试剂；100ml、250ml容量瓶。碘试剂（碘化钾—碘溶液）的配制：称取碘化钾20g及碘10g溶于100ml蒸馏水中。使用前需稀释10倍。四、实验步骤1.葡萄糖标准曲线制作与上述还原糖含量测定相同。2.淀粉的水解取上述还原糖含量测定中经85﹪乙醇浸提后的全部淀粉残渣，放入100ml三角瓶中，加入6mol·L－1盐酸10ml，混匀，在沸水浴中加热10min－30min（用碘试剂检查淀粉水解程度，直至不显蓝色为止），再加蒸馏水20ml,摇匀并过滤于100ml容量瓶中，过滤后残渣再用蒸馏水冲洗3次，一并过滤入容量瓶，定容至100ml。准确取出10ml过滤液置入250ml容量瓶中，加酚酞2滴，用10﹪NaOH中和至微红色，用蒸馏水定容至250ml，待测。3.还原糖含量测定取4支25ml刻度试管，编号，其中3支（三个重复）分别加入待测液2ml,1支空白管加2ml蒸馏水代替样品液，然后各管再加入DNS试剂1.5ml，摇匀，混合液在沸水浴中加热5min，然后用自来水冷却，各加入21.5ml蒸馏水使总体积为25ml，摇匀，在520nm波长下测定吸光度（A）值。五、结果计算根据待测液的吸光度从上述标准曲线中查出其相应的还原糖含量，然后按下公式计算出样品中还原糖（葡萄糖）含量和淀粉含量的百分率。淀粉水解液总量（ml）从标准曲线上查得还原糖(mg)×————————————测定时水解液用量（ml）还原糖（﹪）=———————————————————————————×100（葡萄糖）样品重（mg）粗淀粉含量（﹪）=葡萄糖含量×0.9式中系数0.9依据淀粉（C6H10O5）n水解时吸收n个分子水。86Ⅳ、植物组织中可溶性糖含量的测定（蒽酮法）一、目的掌握蒽酮法测定糖的原理和技术。二、原理糖类（包括单糖、双糖、寡糖）在浓硫酸存在下，脱水生成糠醛或羟甲基糠醛，然后蒽酮与糠醛或羟甲基糠醛经脱水缩合，生成蓝绿色的糠醛衍生物，颜色深浅与糖浓度成正相关。其反应式如下：显色反应与反应温度、加热时间、反应系统中水和硫酸比例有关。本实验通过控制反应系统中水和硫酸比例，利用硫酸与水发生水合作用释放的热能，使反应系统自行升温而达到显色效果免去外加热步骤。蒽酮法具有很高灵敏度，适用于糖的微量测定，且试剂简单，操作简便，因而得到普遍应用。三、材料、仪器设备及试剂1.材料：烘干材料粉末（过筛100目）或剪碎混匀鲜样品。2.仪器设备:分光光度计；电子分析天平；水浴锅；100ml容量瓶；试管；漏斗；剪刀；移液管；洗耳球等。3.试剂及配制：蒽酮试剂：称取蒽酮200mg溶于100ml浓硫酸中。该试剂不能久贮，宜用前配制。100μg·ml－1蔗糖标准母液：准确称取蔗糖100mg于烧杯加少量水溶解后，洗入100ml容量瓶中定容至刻度。四、实验步骤1.蔗糖标准曲线制作1.1取6支试管，编号，按下表配制每管含量为0～100μg蔗糖标准液。87试剂管号012345100μg·ml－1蔗糖标准母液（ml）蒸馏水（ml）02.50.22.3O.42.10.61.90.81.71.01.5每管蔗糖含量（μg）020406080100加入表中试剂后，向各管沿管壁迅速加入蒽酮试剂6.5ml，并立即摇动使混合均匀，置试管架上室温下显色，冷却后倒入比色杯，以0号管作空白对照，在620nm波长处，以多点校准总量法，制作标准曲线。2.样品提取称取干样品粉末100mg或剪碎混匀的鲜样品1g,放入试管中，加入蒸馏水10ml，置于沸水浴中提取20min，冷却后过滤入100ml容量瓶中，以热水冲洗残渣2～3次，一并滤入容量瓶中，待冷至室温，定容至刻度，即为样品待测液。3.糖含量测定吸取待测液0.2ml（含糖量30～80μg）,加入试管中，再加蒸馏水2.3ml，摇匀。随后沿试管壁迅速加入蒽酮试剂6.5ml,立刻摇动混合均匀，置于试管架上显色，冷却至室温后，以空白管作对照，在620nm波长处，按多点校准定量法测定待测管中提取液糖含量。五、结果计算提取液糖含量（μg）————————————×提取液总量（ml）1000×待测液用量（ml）可溶性糖含量（﹪）=—————————————————————×100组织干重（mg）或鲜重（g）×1000