第三章-转录组学概论及其研究方法

2016/12/201第三章转录组学概论本章内容DefinitionHSSHHistoryTechnologyMicroarraySAGEMPSSRNA-seqNormalRNA-seqTruSeqDGEmiRNADegradomeSeqlncRNASinglecellRNA-seq1.定义：转录组和转录组学TranscriptomeandTranscriptomics转录组：广义转录组指从一种细胞或者组织的基因组所转录出来的RNA的总和，包括编码蛋白质的mRNA和各种非编码RNA(rRNA,tRNA,snoRNA,snRNA,microRNA和其他非编码RNA等)。狭义转录组指所有参与翻译蛋白质的mRNA的总和。转录组学：在整体水平上研究生物细胞中转录组的发生和学发变化规律的科学。转录组学从整体水平研究基因的功能和基因结构，揭示特定生物学过程中的分子机理。目前已广泛应用于微生物和动植物基础研究，临床诊断和药物研发等领域。2.转录组学发展史从上世纪90年代中期以来，随着微阵列技术被用于大规模基因表达水平的研究，转录组学便作为一门新技术开始在生物学前沿研究中展露头脚并逐渐成为生命科学研究的热点。究中展露头脚并逐渐成为生命科学研究的热点。原因如下：1、蛋白质组研究需要更多转录组研究的信息：单一蛋白质组的数据不足以清楚地鉴定基因的功能，因此蛋白质组的数据需要转录组的研究结果加以印证。2、非编码RNA研究的不断发展，使得转录组研究的范围不断扩大和深化。3、新一代高通量测序技术运用到转录组研究中，转录组研究中提供的数据量呈现爆炸式扩增，极大拓宽了转录组研究解决科学问题的范围。2016/12/2023.转录组学研究技术抑制差减杂交技术(SuppressionSubtractiveHybridization,SSH)；微阵列技术(Microarray)；基因表达系列分析技术(SerialAnalysisofGeneExpression,SAGE)；大规模平行标签测序技术(MassivelyParallelSignature大规模平行标签测序技术(MassivelyParallelSignatureSequencing,MPSS)；高通量直接全转录组RNA测序技术(RNA-seq)3.1SSHSuppressionSubtractiveHybridization抑制差减杂交定义：是一种基于抑制PCR和差减杂交技术建立的技术，通过一次差减杂交可使低丰度的mRNA序列得以高于1000倍的富集有效的选择性杂交可使低丰度的mRNA序列得以高于1000倍的富集，有效的选择性扩增差异表达序列，同时抑制非差异序列的扩增，在分离低丰度差异表达基因方面具有一定优势。原理：高丰度的单链cDNA在退火时产生同源杂交的速度快于低丰度的单链cDNA，在试验组(tester)和驱动组(driver)的cDNA变性后再复性的过程中，原来在丰度上有差别的单链cDNA达到均一化。同时由于试验组的cDNA在进行杂交之前等分的两份加有不同的接头因此杂交试验组的cDNA在进行杂交之前等分的两份加有不同的接头，因此杂交时将产生5种不同类型的分子，当采用与两个不同接头序列互补的引物进行PCR扩增时，只有差异表达的序列得到有效扩增，非差异表达的序列因两端存在反向重复序列，退火时易产生类似“锅柄”的结构，无法与引物配对，扩增受到抑制。SSH的主要步骤1.cDNA的合成与酶切；2.试验组cDNA分成两份，并与两种不同的接头连接；3.试验组的cDNA与过量的驱动组cDNA杂交；4.选择性PCR扩增与接头相连的试验组cDNA分子；5.克隆PCR产物，构建差减文库；6.筛选文库。2016/12/203SSH的历史应用（十几年以前）研究生物和非生物逆境对植物的影响及生物与寄主植物的互作，以获得植物差异表达基因的表达动态和进行有关转录因子等方面的研究，进而获得植物与逆境互作的关键点，更好地理解其互作机制，为从分子水平上定向培育抗旱、抗寒、抗病等作物提供理论依据；将获得的差异表达基因片段作为分子标记，进行标记辅助选择，为育种服务；择，为育种服务；利用SSH研究作物的衰老、凋亡机制，适当有效地延长或缩短作物的生命周期；研究基因的协同表达。SSH技术的缺陷SSH一般只用于两个样品的差异比较分析，样品间的差异不宜太大或太小，而对于多个样品则无能为力。选取Tester的时期非常关键选择使用该方法时首先要选取Tester的时期非常关键，选择使用该方法时，首先要根据不同的研究目的确定取材的最佳时期，取材时期不当将会给试验带来意想不到的困难，或许只得到很少几个差减克隆或根本得不到克隆，或得到一些非目的克隆。从技术本身讲，提取的testerRNA和driverRNA及从中分离的mRNA的质量限制酶的酶切效率接头的连接效率离的mRNA的质量、限制酶的酶切效率、接头的连接效率、第二次PCR产物的转化效率及差减克隆的筛选方法等关系着验的成败。SSH所需的起始RNA量较大，一般为几微克，对于一些珍贵稀有的RNA材料慎用。3.2Microarray基因芯片：是通过微加工技术将数以万计乃至百万计的特定序列的DNA片段（基因探针）有规律地排列固定于2cm2的硅片、玻片等支持物上，构成一个二维的DNA探针阵列，与计算机的电子芯片相似。芯片杂交：指将标记的样品分子与固定于基因芯片上的基因探针进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列。基因芯片由于同时将大量探针固定于支持物上，所以可以一次性对样品大量序列进行检测和分析，从而解决了传统核酸印迹杂交（SthBltti和NthBltti等）技术操作繁杂自动（SouthernBlotting和NorthernBlotting等）技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等不足。而且，通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的应用价值，如基因表达谱测定、实变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序等。2016/12/204Microarray的基本步骤1.芯片制备：将玻璃片或硅片进行表面处理，然后将DNA片段或蛋白质分子按顺序排列在芯片上。2.样品制备：生物样品往往是非常复杂的生物分子混合体，除少数特殊样品外，一般不能直接与芯片反应。可将样品进行生物处理，获取其中的蛋白质或DNA、RNA，并且加以标记，以提高检测的灵敏度。3.生物分子反应：芯片上的生物分子之间的反应是芯片检测物分子反应芯片的物分子之间的反应是芯片检测的关键一步。通过选择合适的反应条件使生物分子间反应处于最佳状态，减少生物分子之间的错配比率。4.芯片信号检测：将芯片置入芯片扫描仪中，通过扫描以获得有关生物信息。基因芯片技术发展的最终目标是将样品制备、杂交反应到信号检测的整个分析过程集成化以获得微型全Laboratoryonachip反应到信号检测的整个分析过程集成化以获得微型全分析系统(micrototalanalyticalsystem)或称缩微芯片实验室(laboratoryonachip)。使用缩微芯片实验室可以在一个封闭的系统内以使用缩微芯片实验室，可以在个封闭的系统内以很短的时间完成从原始样品到获取所需分析结果的全套操作。2016/12/205Microarray的历史应用（十几年前开始）理论研究：包括基因表达检测、突变检测、基因组多态性分析和基因文库作图以及杂交测序等性分析和基因文库作图以及杂交测序等；实际应用：广泛应用于疾病诊断和治疗、药物筛选、农作物的优育优选、司法鉴定、食品卫生监督、环境检测、国防、航天等许多领域。历史贡献：它为人类认识生命的起源、遗传、发育与进化、为人类疾病的诊断、治疗和防治开辟全新的途径，为生物大分子的全新设计和药物开发中先导化合物的快速筛选和药物基因组学研究提供技术支撑平台。基于杂交技术的DNA芯片技术只适用于检测已知序列，无Microarray的缺陷法捕获新的mRNA。由于杂交技术灵敏度有限，对于低丰度的mRNA，微阵列技术难以检测，也无法捕获到目的基因mRNA表达水平的微小变化。技术成本昂贵、复杂、检测灵敏度较低、重复性差、分析技术成本昂贵、复杂、检测灵敏度较低、重复性差、分析泛围较狭窄等。这些问题主要表现在样品的制备、探针合成与固定、分子的标记、数据的读取与分析等几个方面。3.3SAGESerialAnalysisofGeneExpressionSAGE是以Sanger测序为基础用来分析基因群体表达状态的一项技术。SAGE技术首先是提取实验样品中的RNA并反转录成cDNA，随后用锚定酶(Anchoringenzyme)切割双链cDNA，接着将切割的cDNA片段与不同的接头连接，通过标签酶酶切处理并得到SAGE标签，然后PCR扩增连接SAGE标签形成的标签二聚体，最后通过锚定酶切除接头序列以形成标签二聚体的多聚体并对其进行测序列以形成标签二聚体的多聚体并对其进行测序。SAGE可以在组织和细胞中定量分析相关基因的表达水平。在差异表达谱的研究中，SAGE可以获得完整的转录组学图谱以及发现新的基因并鉴定其功能、作用机制和通路等。2016/12/206SAGE的原理一个9-10bp的短核苷酸序列标签包含有足够的信息，能够唯一确认一种转录物。例如，一个9bp顺序能够分辨262144个不同的转录物(49)，而人类基因组估计仅能编码80000种转录物，所以理论上每一个9bp标签能够代表一种转录物的特征序列。如果能将9bp的标签集中于一个克隆中进行测序，并将得到的短序列核苷酸顺序以连续的数据形式输入计算机中进行处理，就能对数以千计的mRNA转录物进行分析。SAGE的步骤1.以生物素标记的oligo(dT)为引物反转录合成cDNA，以一种限制性内切酶（锚定酶，AE）酶切。锚定酶要求至少在每一种转录物上有一个酶切位点，一般4bp限制性内切酶能达到这种要求，因为大多数mRNA要长于256bp(44)。通过链霉抗生物素蛋白珠收集cDNA3′端部分。对每一个mRNA只收集其polyA尾与最近的酶切位点之间的片段最近的酶切位点之间的片段。2.将cDNA等分为A和B两份，分别连接接头A或接头B。每一种接头都含有标签酶(TaggingEnzyme,TE)酶切位点序列（标签酶是一种II型限制酶，它能在距识别位点约20bp的位置切割DNA双链）。接头的结构为引物A/B序列+标签酶识别位点+锚定酶识别位点。3.用标签酶酶切产生连有接头的短cDNA片段（约9-10bp），混合并连接两个cDNA池的短cDNA片段，构成双标签后，以引物A和B扩增。4.用锚定酶切割扩增产物，抽提双标签（Ditag）片段并克隆、测序。一般每一个克隆最少有10个标签序列，克隆的标签数处于10-50之间。5.对标签数据进行处理。在所测序列中的每个标签间以锚定酶序列间隔，由于双标签体的长度基本相同，不会导致扩增的偏态性，同时数量和种类极大的转录物使同一种标签连接成双标签体的可能性极小，这保证了克隆中的每一个标签代表一种转录物在当前细胞状态下的一个单位的转录产物，因此通过计算机软件的分析能够得到上千种基因表达产物的标签序列以及丰度。SAGE的历史应用1.SAGE应用于人类基因组研究。SAGE能够快速、全范围提取生物体基因表达信息，对已知基因进行量化分析。2SAGE也能应用于寻找新基因虽然SAGE的标签仅包括9个碱基但加上锚定2.SAGE也能应用于寻找新基因。虽然SAGE的标签仅包括9个碱基，但加上锚定酶的位点序列（4个碱基）共可确认13碱基序列。如果一个标签检索已知序列时没有同源序列，13碱基片段就可作为探针筛选cDNA文库得到cDNA克隆。3.SAGE可用于定量比较不同状态下的组织细胞的特异基因表达。4.由于SAGE能够同时最大限度的收集一种基因组的基因表达信息，转录物的分析数据可用来构建染色体表达图谱（Chromosomalexpressionmap）。利用基因的表达信息与基因